Elektroporeringsbasert genetisk modifisering av primære humane pigmentepitelceller ved bruk av Tornerose Transposon-systemet

Summary

Vi har utviklet en protokoll for å transfektere primære humane pigmentepitelceller ved elektroporering med genet som koder for pigmentepitelavledet faktor (PEDF) ved hjelp av Tornerose (SB) transposonsystemet. Vellykket transfeksjon ble demonstrert ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR), immunoblotting og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA).

Abstract

Vårt stadig aldrende samfunn fører til en økende forekomst av nevrodegenerative sykdommer. Så langt er de patologiske mekanismene utilstrekkelig forstått, og hindrer dermed etableringen av definerte behandlinger. Cellebaserte additive genterapier for økt ekspresjon av en beskyttende faktor anses som et lovende alternativ for å medisinere nevrodegenerative sykdommer, for eksempel aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Vi har utviklet en metode for stabilt uttrykk av genet som koder for pigmentepitel-avledet faktor (PEDF), som er karakterisert som et nevrobeskyttende og antiangiogent protein i nervesystemet, inn i genomet til primære humane pigmentepitelceller (PE) ved hjelp av Tornerose (SB) transposonsystemet. Primære PE-celler ble isolert fra menneskelige donorøyne og opprettholdt i kultur. Etter å ha nådd sammenløp ble 1 x 10⁴ celler suspendert i 11 μL resuspenderingsbuffer og kombinert med 2 μL av en renset løsning inneholdende 30 ng hyperaktiv SB (SB100X) transposaseplasmid og 470 ng PEDF transposon plasmid. Genmodifisering ble utført med et kapillær elektroporeringssystem ved bruk av følgende parametere: to pulser med en spenning på 1.100 V og en bredde på 20 ms. Transfiserte celler ble overført til kulturplater som inneholdt medium supplert med føtalt bovint serum; Antibiotika og antimykotika ble tilsatt ved første medium utveksling. Vellykket transfeksjon ble demonstrert i uavhengig utførte eksperimenter. Kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) viste økt ekspresjon av PEDF-transgenet . PEDF-sekresjonen var signifikant forhøyet og forble stabil, evaluert ved immunblotting, og kvantifisert ved enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). SB100X-mediert overføring tillot en stabil PEDF-genintegrasjon i genomet til PE-celler og sikret kontinuerlig sekresjon av PEDF , noe som er kritisk for utviklingen av en cellebasert gentilskuddsterapi for å behandle AMD eller andre retinale degenerative sykdommer. Videre indikerte analyse av integrasjonsprofilen til PEDF-transposonet til humane PE-celler en nesten tilfeldig genomisk fordeling.

Introduction

Avansert alder er beskrevet å være den viktigste risikoen for nevrodegenerative sykdommer. Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), en polygen sykdom som fører til alvorlig synstap hos pasienter eldre enn 60 år, tilhører de fire vanligste årsakene til blindhet og synshemming¹ og forventes å øke til 288 millioner mennesker i 2040². Dysfunksjoner av retinalpigmentepitelet (RPE), et enkelt lag med tettpakkede celler som ligger mellom choriocapillaris og retinale fotoreceptorer, bidrar til patogenesen av AMD. RPE oppfyller flere oppgaver som er avgjørende for en normal retinal funksjon³ og utskiller en rekke vekstfaktorer og faktorer som er avgjørende for å opprettholde den strukturelle integriteten til netthinnen og choriocapillaris, og støtter dermed fotoreseptoroverlevelse og gir grunnlag for sirkulasjon og tilførsel av næringsstoffer.

I sunne øyne er pigmentepitelavledet faktor (PEDF) ansvarlig for å balansere effekten av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og beskytter nevroner mot apoptose, forhindrer endotelcelleproliferasjon og stabiliserer kapillærendotelet. Et forskjøvet VEGF-til-PEDEF-forhold er relatert til okulær neovaskularisering, som ble observert i dyremodeller^4,5 samt i prøver av pasienter med koroidal neovaskularisering (CNV) på grunn av AMD og proliferativ diabetisk retinopati 6,7,8,9,10 . Den forbedrede VEGF-konsentrasjonen er målet for dagens standardbehandling. Anti-VEGF-legemidlene bevacizumab, ranibizumab, aflibercept og senest brolucizumab forbedrer synsstyrken hos omtrent en tredjedel av CNV-pasientene eller rettere stabiliserer synet i 90% av tilfellene^11,12,13. De hyppige, ofte månedlige, intravitreale injeksjonene bærer imidlertid risikoen for bivirkninger¹⁴, svekker pasientetterlevelsen og representerer en betydelig økonomisk byrde for helsevesenet¹⁵. Videre reagerer en viss prosentandel av pasientene (2% -20%) ikke eller reagerer bare dårlig på anti-VEGF-terapien^16,17,18,19. Disse negative sammenhengene nødvendiggjør utvikling av alternative behandlinger, f.eks. intraokulære implantater, celle- og/eller genterapeutiske tilnærminger.

Genterapi har utviklet seg som lovende behandling for arvelige og ikke-arvelige sykdommer og har til hensikt å gjenopprette ikke-funksjonelle gensekvenser eller undertrykke funksjonsfeil. For polygene sykdommer, hvor identifisering og erstatning av årsaksfaktorene knapt er mulig, tar strategier sikte på kontinuerlig levering av en beskyttende faktor. Når det gjelder AMD, er det utviklet forskjellige additive terapier, for eksempel stabilt ekspresjon av endostatin og angiostatin 20, VEGF-antagonisten løselig fms-lignende tyrosinkinase-1 (sFLT-1) 21,22, komplementregulerende proteinklynge av differensiering 59 (CD59) ²³ eller PEDF ^24,25 . Øyet, og spesielt netthinnen, er et utmerket mål for en genbasert medisinering på grunn av den lukkede strukturen, god tilgjengelighet, liten størrelse og immunprivilegi, noe som muliggjør en lokalisert levering av lave terapeutiske doser og gjør transplantasjoner mindre utsatt for avvisning. Videre muliggjør øyet ikke-invasiv overvåking, og netthinnen kan undersøkes ved hjelp av forskjellige bildebehandlingsteknikker.

Virale vektorer er, på grunn av deres høye transduksjonseffektivitet, det viktigste kjøretøyet for å levere terapeutiske gener til målceller. Avhengig av hvilken virusvektor som brukes, er det imidlertid beskrevet forskjellige bivirkninger, for eksempel immun- og inflammatoriske responser²⁶, mutagene og onkogene effekter ^27,28 eller spredning i andre vev²⁹. Praktiske begrensninger inkluderer en begrenset emballasjestørrelse³⁰, samt vanskeligheter og kostnader forbundet med produksjon av kliniske partier^31,32. Disse ulempene har fremmet videreutvikling av ikke-virale, plasmidbaserte vektorer som overføres via lipo- / polyplexer, ultralyd eller elektroporering. Imidlertid blir genomisk integrasjon av transgenet i vertsgenomet vanligvis ikke fremmet med plasmidvektorer, noe som resulterer i et forbigående uttrykk.

Transposoner er naturlig forekommende DNA-fragmenter som endrer sin posisjon i genomet, en egenskap som er vedtatt for genterapi. På grunn av en aktiv integrasjonsmekanisme tillater transposonbaserte vektorsystemer et kontinuerlig og konstant uttrykk for det innsatte transgenet. Tornerosetransposonen, rekonstituert fra en gammel Tc1/mariner-type transposon funnet i fisk 33 og ytterligere forbedret ved molekylær evolusjon som resulterte i den hyperaktive varianten SB100X³⁴, muliggjorde effektiv transposisjon i forskjellige primærceller og ble brukt til fenotypisk korreksjon i forskjellige sykdomsmodeller ³⁵. For tiden er 13 kliniske studier initiert ved bruk av SB transposon-systemet. SB100X transposon-systemet består av to komponenter: transposonet, som består av genet av interesse flankert av terminale inverterte repetisjoner (TIR), og transposasen, som mobiliserer transposonet. Etter plasmid-DNA-levering til cellene binder transposasen TIR-ene og katalyserer eksisjonen og integrasjonen av transposonet i cellens genom.

Vi har utviklet en ikke-viral cellebasert additiv terapi for behandling av neovaskulær AMD. Tilnærmingen omfatter elektroporeringsbasert innsetting av PEDF-genet i primære pigmentepitelceller (PE) ved hjelp av SB100X transposonsystemet^36,37,38. Den genetiske informasjonen til transposasen og PEDF er gitt på separate plasmider, og muliggjør dermed justering av det ideelle SB100X-til-PEDF transposonforholdet. Elektroporering utføres ved hjelp av et pipettebasert kapillærtransfeksjonssystem som er preget av en maksimert gapstørrelse mellom elektrodene samtidig som overflatearealet minimeres. Enheten ble vist å oppnå gode transfeksjonshastigheter i et bredt spekter av pattedyrceller 39,40,41. Den lille elektrodeoverflaten gir et jevnt elektrisk felt og reduserer de ulike bivirkningene av elektrolyse⁴².

Den anti-angiogene funksjonaliteten til PEDF utskilt av transfekterte pigmentepitelceller ble vist i forskjellige in vitro-eksperimenter som analyserte spiring, migrasjon og apoptose av humane navlestrengendotelceller⁴³. I tillegg viste transplantasjon av PEDF-transfekterte celler i en kaninmodell av hornhinnen neovaskularisering⁴⁴ samt en rottemodell av CNV^43,45,46 nedgang i neovaskularisering.

Her beskriver vi en detaljert protokoll for stabil innsetting av PEDF-genet i primære humane RPE-celler via SB100X transposon-systemet ved hjelp av et kapillærtransfeksjonssystem. De transfiserte cellene ble holdt i kultur i 21 dager og deretter analysert i form av PEDF-genuttrykk ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) og i form av PEDF-proteinsekresjon ved immunoblotting og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA, figur 1).

Protocol

Donorøyne hos mennesker ble innhentet fra Aachen Cornea Bank ved Øyeavdelingen (Universitetssykehuset RWTH Aachen) etter å ha innhentet informert samtykke i samsvar med Helsinkideklarasjonens protokoller. Prosedyrer for innsamling og bruk av prøver fra mennesker er godkjent av institusjonens etiske komité. 1. Isolering av primære humane RPE-celler Legg ut sterile verneklær og hansker. Plasser en steril drapering under en laminær strøm. Plasser sterile forberedelses…

Representative Results

Dyrking og elektroporering av primære humane RPE-cellerVi har vist at såing av et tilstrekkelig antall primære RPE-celler av animalsk opprinnelse muliggjør dyrking og vekst til et integrert monolag av pigmenterte, sekskantede celler36,37,48. Deres evne til å danne tette kryss, å utvise fagocytisk aktivitet og å uttrykke spesifikke markørgener in vitro<sup class="xref"…

Discussion

I vårt prosjekt tar vi sikte på ikke-viral produksjon av genmodifiserte primære humane RPE-celler som kontinuerlig overuttrykker og utskiller en effektiv faktor for å bruke de transfiserte cellene som langsiktig terapeutisk for etablering og vedlikehold av et beskyttende miljø. Vi har etablert introduksjonen av genet som koder for PEDF, et allestedsnærværende uttrykt multifunksjonelt protein med antiangiogene og nevrobeskyttende funksjoner. Protokollen beskrevet her kan brukes til stabilt og reproduserbart transfe…

Materials

Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Colibri Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18950
Curved Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18856
Disposable Scalpel (No. 11)	Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor	Geuder, Heidelberg, Germany	G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Glass Pasteur Pipettes	Brand, Wertheim, Germany	747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress	Fink-Walter, Merchweiler, Germany	321063
Sterile Gloves	Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Sterile Surgical Gown	Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Inverted Microscope	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany	Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+	Biochrom, Berlin, Germany	L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)	Qiagen, Hilden, Germany	34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab6721
Human PEDF ELISA Kit	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Imaging System	Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument	Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Germany	12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl)	Roche Life Science, Penzberg, Germany	4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Germany	30410
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1645050
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
Reverse Transcription System	Promega, Madison, WI	A3500
RNase-Free DNase Set	Qiagen, Hilden, Germany	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Rocking Shaker	Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom	SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1704150
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054