Fabbricazione di piattaforme magnetiche per l'organizzazione su scala micron di neuroni interconnessi
Summary
Questo lavoro presenta un approccio dal basso verso l’alto all’ingegneria delle forze magnetiche locali per il controllo dell’organizzazione neuronale. Le cellule simili a neuroni cariche di nanoparticelle magnetiche (MNP) sono placcate in cima e controllate da una piattaforma micro-modellata con magnetizzazione perpendicolare. Sono descritti anche la caratterizzazione magnetica, l’assorbimento cellulare MNP, la vitalità cellulare e l’analisi statistica.
Abstract
La capacità di indirizzare i neuroni verso reti neurali organizzate ha grandi implicazioni per la medicina rigenerativa, l’ingegneria tissutale e il bio-interfacciamento. Molti studi hanno mirato a dirigere i neuroni usando segnali chimici e topografici. Tuttavia, le segnalazioni di controllo organizzativo su scala micron su vaste aree sono scarse. Qui, è stato descritto un metodo efficace per posizionare i neuroni in siti preimpostati e guidare la crescita neuronale con risoluzione su scala micron, utilizzando piattaforme magnetiche incorporate con elementi magnetici micro-modellati. È stato dimostrato che il caricamento di neuroni con nanoparticelle magnetiche (MNP) li converte in unità magnetiche sensibili che possono essere influenzate da gradienti magnetici. Seguendo questo approccio, è stata fabbricata una piattaforma magnetica unica su cui le cellule PC12, un modello comune simile a un neurone, sono state placcate e caricate con nanoparticelle superparamagnetiche. Sottili pellicole di multistrati ferromagnetici (FM) con magnetizzazione perpendicolare stabile sono state depositate per fornire forze di attrazione efficaci verso i modelli magnetici. Queste celle PC12 cariche di MNP, placcate e differenziate in cima alle piattaforme magnetiche, erano direttamente attaccate ai modelli magnetici, e la crescita della neurite era ben allineata con la forma del modello, formando reti orientate. Vengono presentati metodi di caratterizzazione quantitativa delle proprietà magnetiche, assorbimento MNP cellulare, vitalità cellulare e analisi statistica dei risultati. Questo approccio consente il controllo della formazione di reti neurali e migliora l’interfaccia neurone-elettrodo attraverso la manipolazione delle forze magnetiche, che può essere uno strumento efficace per gli studi in vitro sulle reti e può offrire nuove direzioni terapeutiche di biointerfazione.
Introduction
La micropatterning dei neuroni ha un grande potenziale per larigenerazione tissutale 1,2,3,4,5 e lo sviluppo di dispositivi neuro-elettronici6,7,8. Tuttavia, il posizionamento in scala micron dei neuroni ad alta risoluzione spaziale, come nei tessuti biologici, rappresenta una sfida significativa. La formazione di strutture predesignate su questa scala richiede la guida dei processi cellulari nervosi controllando localmente la motilità del soma e la crescita asonale. Studi precedenti hanno suggerito l’uso di segnali chimici e fisici9,10,11,12 per guidare la crescita neuronale. Qui, un nuovo approccio si concentra sul controllo del posizionamento cellulare in base ai gradienti dicampo magnetico 13,14,15,16,17, trasformando le celle cariche di MNP in unità sensibili al magnetico, che possono essere manipolate a distanza.
Kunze et al., che ha caratterizzato la forza necessaria per indurre le risposte cellulari usando cellule a chip magnetico e cariche di MNP, ha dimostrato che l’allungamento assionale precoce può essere innescato dalla tensione meccanica all’interno dellecelle 18. ha confermato che i substrati micro-fabbricati con gradienti di campo magnetico migliorati consentono la stimolazione wireless dei circuiti neurali dosati con MNP utilizzando coloranti indicatori calcio19. Inoltre, le nanoparticelle unite all’interno delle cellule, con conseguente forza localizzata mediata da nanoparticelle che si avvicinavano alla tensione cellulare20. Ciò ha portato alla fabbricazione di modelli definiti di substrati micromagnetici che hanno contribuito a studiare la risposta cellulare alle forze meccaniche. La tensione cellulare derivante dall’applicazione di forze localizzate mediate da nanoparticelle è stata raggiunta coalescenza di nanoparticelle all’interno dellecellule 20. Un sistema ibrido complementare di semiconduttori di ossido metallico (CMOS) -microfluidico è stato sviluppato da Lee et al.
ha utilizzato cuscinetti magnetici su microbila scala, pre-programmati come “punti caldi” magnetici per localizzare le celle22. Un’attività specifica potrebbe anche essere stimolata all’interno delle cellule utilizzando array magnetici micro-modellati per localizzare nanoparticelle in specifiche posizioni subcellulari23. L’assorbimento dell’MNP cellulare è stato dimostrato con successo nei neuroni primari di sanguisughe, ratti e topi24,25,26. Qui, questo è stato dimostrato su una linea cellulare feocromocitoma PC12 ratto, che è stato precedentemente segnalato per mostrare un elevato assorbimento di MNPs27. Negli ultimi anni, ci sono state varie applicazioni mediche di MNPs, tra cui la somministrazione di farmaci e la termoterapia nei trattamenti contro ilcancro 28,29,30,31. Nello specifico, gli studi riguardano l’applicazione di MNP e retineuronali 32,33,34,35. Tuttavia, l’organizzazione magnetica dei neuroni che utilizzano MNP a livello di una singola cellula merita ulteriori indagini.
In questo lavoro, è stato descritto un approccio dal basso verso l’alto per progettare forze magnetiche locali attraverso piattaforme predesignate per il controllo della disposizione neuronale. È stata presentata la fabbricazione di modelli su scala micron di multistrati FM. Questa struttura multistrato FM unica crea una magnetizzazione perpendicolare stabile che si traduce in forze di attrazione efficaci verso tutti i modelli magnetici. Attraverso l’incubazione, i MNP sono stati caricati in celle PC12, trasformandoli in unità sensibili magnetiche. Le celle cariche di MNP, placcate e differenziate in cima alle piattaforme magnetiche, erano preferenzialmente attaccate ai modelli magnetici, e la crescita della neurite era ben allineata con la forma del modello, formando reti orientate. Sono stati descritti diversi metodi per caratterizzare le proprietà magnetiche dei multistrati FM e degli MNP, e sono state presentate anche tecniche per l’assorbimento dell’MNP cellulare e i test di vitalità cellulare. Inoltre, i parametri morfometrici della crescita neuronale e l’analisi statistica dei risultati sono dettagliati.
Protocol
Representative Results
Discussion
I risultati rappresentativi dimostrano l’efficacia della metodologia presentata per il controllo e l’organizzazione della formazione della rete neuronale su scala micron. Le celle PC12 caricate da MNP rimasero vitali e furono trasformate in unità sensibili magnetiche che furono attratte dalle forze magnetiche dagli elettrodi FM a siti specifici. Ciò è dimostrato al meglio nella figura 5C, dove le cellule hanno aderito preferenzialmente ai vertici più grandi degli esagoni e non alle linee…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal Ministero della Scienza & Tecnologia, Israele, e dalla Israeli Science Foundation (569/16).
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15710 | |
| 6-well cell culture plate | FALCON | 353846 | |
| 96-well cell culture plate | SPL life sciences | 30096 | |
| Amphotericin B solution | Biological Industries | 03-028-1B | |
| AZ 1514H photoresist | MicroChemicals GmbH | ||
| AZ 351 B developer | MicroChemicals GmbH | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Biological Industries | 03-010-1B | |
| Cell and Tissue cultur flask | Biofil | TCF002250 | 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One | 627-160 | 35 mm |
| Cell Proliferation Kit (XTT-based) | Biological Industries | 20-300-1000 | |
| Centrifuge tube | Biofil | CFT021500 | 50 mL |
| Co80Fe20 at% sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Collagen type I | Corning Inc. | 354236 | Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-165-152 | |
| DAPI fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Disposable needle | KDL | 23 G | |
| Disposable syringe | Medispo | 1160227640 | 10 mL |
| Donor horse serum | Biological Industries | 04-124-1A | |
| ELISA reader | Merk Millipore | BioTek synergy 4 hybrid microplate reader | |
| Ethanol 70% | ROMICAL LTD | 19-009102-80 | |
| Ethanol absolute (Dehydrated) | Biolab-chemicals | 52505 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| Fresh murine β-NGF | Peprotech | 450-34 | |
| GMW C-frame electromagnet . | Buckley systems LTD | 3470, 45 mm | |
| Hydrochloric acid 32% | DAEJUNG CHEMICAL & METALS | 4170-4100 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health, Bethesda | NeuronJ plugin | |
| Inductively coupled plasma (ICP) | Ametek Spectro | SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma | |
| Keithley source-measure | Keithley | 2400 | |
| Keithley switching system | Keithley | 3700 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Light microscope | Leica | DMIL LED | |
| Maskless photolithography | Heidelberg Inst. | MLA150 | |
| Microscope Slides | BAR-NAOR | BN1042000C | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 438073 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Sigma | D9663 | |
| PBS 10x | hylabs | BP507/1LD | |
| PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
| Pd sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Penicillin-streptomycin nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| PrestoBlue cell viability reagent | Molecular probes | A-13261 | resazurin-based |
| Rabbit antibody to α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | ||
| RF magnetron sputtering system | Orion AJA Int. | Orion 8 | |
| RPMI 1640 with l-glutamine | Biological Industries | 01-100-1A | |
| Sonication bath | KUDOS | SK3210HP | Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W |
| SQUID magnetometer | Quantum Design, CA | ||
| Triton X-100 | CHEM-IMPEX INTERNATIONAL | 1279 | non-ionic surfactant |
| XTT cell viability reagent |
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