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Bioengenharia

Fabricação de plataformas magnéticas para organização em escala de micron de neurônios interligados

Published: July 14, 2021
doi:
10.3791/62013
, , , , , , , ,
1Department of Physics,Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering,Bar-Ilan University, 3Department of chemistry,Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials,Bar-Ilan University

Summary

Este trabalho apresenta uma abordagem de baixo para cima para a engenharia de forças magnéticas locais para o controle da organização neuronal. Células semelhantes a neurônios carregadas com nanopartículas magnéticas (MNPs) são banhadas no topo e controladas por uma plataforma micro-padronizada com magnetização perpendicular. Também são descritas caracterização magnética, captação celular MNP, viabilidade celular e análise estatística.

Abstract

A capacidade de direcionar neurônios para redes neurais organizadas tem grandes implicações para medicina regenerativa, engenharia de tecidos e bio-interligação. Muitos estudos têm como objetivo direcionar neurônios usando pistas químicas e topográficas. No entanto, os relatos de controle organizacional em escala de micron sobre grandes áreas são escassos. Aqui, um método eficaz foi descrito para colocar neurônios em locais predefinidos e orientar o crescimento neuronal com resolução em escala de micron, usando plataformas magnéticas incorporadas com elementos magnéticos micro-padronizados. Foi demonstrado que carregar neurônios com nanopartículas magnéticas (MNPs) os converte em unidades magnéticas sensíveis que podem ser influenciadas por gradientes magnéticos. Após essa abordagem, uma plataforma magnética única foi fabricada na qual as células PC12, um modelo comum semelhante a neurônios, foram banhadas e carregadas com nanopartículas superparammagnéticas. Filmes finos de multicamadas ferromagnéticas (FM) com magnetização perpendicular estável foram depositados para fornecer forças de atração eficazes em direção aos padrões magnéticos. Estas células PC12 carregadas de MNP, banhadas e diferenciadas no topo das plataformas magnéticas, foram preferencialmente ligadas aos padrões magnéticos, e o crescimento de neurita estava bem alinhado com a forma de padrão, formando redes orientadas. São apresentados métodos quantitativos de caracterização das propriedades magnéticas, captação de MNP celular, viabilidade celular e análise estatística dos resultados. Essa abordagem permite o controle da formação da rede neural e melhora a interface neurônio-eletrodo através da manipulação de forças magnéticas, que pode ser uma ferramenta eficaz para estudos in vitro de redes e pode oferecer novas direções terapêuticas biointerfacing.

Introduction

A micropatters de neurônios tem grande potencial para a regeneração tecidual1,2,3,4,5 e o desenvolvimento de dispositivos neuroeletráticos6,7,8. No entanto, o posicionamento em escala de micron de neurônios em alta resolução espacial, como nos tecidos biológicos, representa um desafio significativo. A formação de estruturas pré-escaladas nesta escala requer a orientação dos processos de células nervosas controlando localmente a soma motilidade e o crescimento axonal. Estudos anteriores sugeriram o uso de pistas químicas e físicas9,10,11,12 para orientar o crescimento neuronal. Aqui, uma nova abordagem se concentra no controle do posicionamento celular por gradientes de campo magnético13,14,15,16,17, transformando células carregadas com MNPs em unidades sensíveis ao magnético, que podem ser remotamente manipuladas.

Kunze et al., que caracterizaram a força necessária para induzir respostas celulares usando células magnéticas carregadas de chip e MNP, provaram que o alongamento axonal precoce pode ser desencadeado pela tensão mecânica dentro das células18. Tay et al. confirmaram que substratos micro-fabricados com gradientes de campo magnético aprimorados permitem a estimulação sem fio de circuitos neurais dosados com MNPs usando corantes indicadores de cálcio19. Além disso, Tseng et al. coalesced nanopartículas dentro das células, resultando em forças localizadas mediadas por nanopartículas que se aproximavam da tensão celular20. Isso levou à fabricação de padrões definidos de substratos micromagnéticos que ajudaram a estudar a resposta celular às forças mecânicas. A tensão celular decorrente da aplicação de forças localizadas mediadas por nanopartículas foi alcançada por nanopartículas de coalizão dentro das células20. Um sistema híbrido complementar de óxido de metal (CMOS) microfluidic foi desenvolvido por Lee et al. que incorporaram uma matriz de micro-eletroímãs no chip CMOS para controlar o movimento de células individuais marcadas com contas magnéticas21.

Alon et al. usaram almofadas magnéticas em microescala, pré-programadas como “pontos quentes” magnéticos para localizar células22. Atividade específica também poderia ser estimulada dentro de células usando matrizes magnéticas micro-padronizadas para localização de nanopartículas em locais subcelulares específicos23. A absorção de MNP celular foi demonstrada com sucesso nos neurônios primários de sanguessuga, rato e rato24,25,26. Aqui, isso foi demonstrado em uma linha celular de feocromocitoma pc12 rato, que foi relatado anteriormente para mostrar alta absorção de MNPs27. Nos últimos anos, houve diversas aplicações médicas de MNPs, incluindo entrega de medicamentos e termoterapia em tratamentos oncológicos28,29,30,31. Especificamente, os estudos tratam da aplicação de MNPs e redes de neurônios32,33,34,35. No entanto, a organização magnética de neurônios usando MNPs em um nível de célula única merece uma investigação mais aprofundada.

Neste trabalho, uma abordagem de baixo para cima foi descrita para projetar forças magnéticas locais através de plataformas pré-projetadas para controlar o arranjo neuronal. A fabricação de padrões em escala de micron de multicamadas FM foi apresentada. Esta estrutura multicamadas FM única cria magnetização perpendicular estável que resulta em forças de atração eficazes em direção a todos os padrões magnéticos. Via incubação, os MNPs foram carregados em células PC12, transformando-as em unidades sensíveis magnéticas. As células carregadas de MNP, banhadas e diferenciadas no topo das plataformas magnéticas, eram preferencialmente ligadas aos padrões magnéticos, e o crescimento de neurita estava bem alinhado com a forma de padrão, formando redes orientadas. Vários métodos foram descritos para caracterizar as propriedades magnéticas das multicamadas FM e dos MNPs, e técnicas de captação de MNP celular e ensaios de viabilidade celular também foram apresentadas. Além disso, parâmetros morfométricos de crescimento neuronal e análise estatística dos resultados são detalhados.

Protocol

NOTA: Realize todas as reações biológicas em um armário de biossegurança. 1. Fabricação de plataformas magnéticas litografia Corte os slides de vidro em 2 x 2 cm2 usando uma caneta escribra. Limpe as lâminas de vidro em acetona e, em seguida, isopropanol por 5 min cada em um banho de ultra-sônicação. Seque com nitrogênio de pureza ultra-alta (UHP). Cubra o vidro com fotoresistia usando revestimento de spin a 6.000 rpm por 60 s, para atingir …

Representative Results

Plataformas magnéticas com diferentes formas geométricas foram fabricadas(Figura 1A). Os padrões magnéticos foram depositados por sputtering: 14 multicamadas de Co80Fe20 e Pd, 0,2 nm e 1 nm, respectivamente. A microscopia eletrônica revelou a altura total dos padrões magnéticos a ~18 nm(Figura 1B). Esta deposição multicamada FM única cria uma plataforma estável com anisotropia de magnetização pe…

Discussion

Os resultados representativos demonstram a eficácia da metodologia apresentada para controlar e organizar a formação da rede neuronal na escala de míccros. As células PC12 carregadas por MNP permaneceram viáveis e foram transformadas em unidades sensíveis magnéticas que foram atraídas pelas forças magnéticas dos eletrodos FM para locais específicos. Isso é melhor demonstrado na Figura 5C,onde as células preferencialmente aderiram aos vértices maiores dos hexágonos e não às …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo Ministério da Ciência & Tecnologia, Israel, e pela Fundação israelense de Ciência (569/16).

Materials

16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent
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Referências

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Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).
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