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Artigo de método

Fabricação de plataformas magnéticas para organização em escala de micron de neurônios interligados

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DOI:

10.3791/62013

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14 de julho de 2021

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Neste artigo

Resumo

Este trabalho apresenta uma abordagem de baixo para cima para a engenharia de forças magnéticas locais para o controle da organização neuronal. Células semelhantes a neurônios carregadas com nanopartículas magnéticas (MNPs) são banhadas no topo e controladas por uma plataforma micro-padronizada com magnetização perpendicular. Também são descritas caracterização magnética, captação celular MNP, viabilidade celular e análise estatística.

Resumo

A capacidade de direcionar neurônios para redes neurais organizadas tem grandes implicações para medicina regenerativa, engenharia de tecidos e bio-interligação. Muitos estudos têm como objetivo direcionar neurônios usando pistas químicas e topográficas. No entanto, os relatos de controle organizacional em escala de micron sobre grandes áreas são escassos. Aqui, um método eficaz foi descrito para colocar neurônios em locais predefinidos e orientar o crescimento neuronal com resolução em escala de micron, usando plataformas magnéticas incorporadas com elementos magnéticos micro-padronizados. Foi demonstrado que carregar neurônios com nanopartículas magnéticas (MNPs) os converte em unidades magnéticas sensíveis que podem ser influenciadas por gradientes magnéticos. Após essa abordagem, uma plataforma magnética única foi fabricada na qual as células PC12, um modelo comum semelhante a neurônios, foram banhadas e carregadas com nanopartículas superparammagnéticas. Filmes finos de multicamadas ferromagnéticas (FM) com magnetização perpendicular estável foram depositados para fornecer forças de atração eficazes em direção aos padrões magnéticos. Estas células PC12 carregadas de MNP, banhadas e diferenciadas no topo das plataformas magnéticas, foram preferencialmente ligadas aos padrões magnéticos, e o crescimento de neurita estava bem alinhado com a forma de padrão, formando redes orientadas. São apresentados métodos quantitativos de caracterização das propriedades magnéticas, captação de MNP celular, viabilidade celular e análise estatística dos resultados. Essa abordagem permite o controle da formação da rede neural e melhora a interface neurônio-eletrodo através da manipulação de forças magnéticas, que pode ser uma ferramenta eficaz para estudos in vitro de redes e pode oferecer novas direções terapêuticas biointerfacing.

Introdução

A micropatters de neurônios tem grande potencial para a regeneração tecidual1,2,3,4,5 e o desenvolvimento de dispositivos neuroeletráticos6,7,8. No entanto, o posicionamento em escala de micron de neurônios em alta resolução espacial, como nos tecidos biológicos, representa um desafio significativo. A formação de estruturas pré-escaladas nesta escala requer a orientação dos processos de células nervosas controlando....

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Protocolo

NOTA: Realize todas as reações biológicas em um armário de biossegurança.

1. Fabricação de plataformas magnéticas

  1. litografia
    1. Corte os slides de vidro em 2 x 2 cm2 usando uma caneta escribra. Limpe as lâminas de vidro em acetona e, em seguida, isopropanol por 5 min cada em um banho de ultra-sônicação. Seque com nitrogênio de pureza ultra-alta (UHP).
    2. Cubra o vidro com fotoresistia usando revestimento de spin a 6.000 rpm por 60 s, para atingir 1,5 μm de espessura, e asse a 100 °C por 60 s. Exponha a amostra a uma fonte de luz, usando um comprimento de onda apropriado para fotoresist, com um padrão deseja....

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Resultados

Plataformas magnéticas com diferentes formas geométricas foram fabricadas(Figura 1A). Os padrões magnéticos foram depositados por sputtering: 14 multicamadas de Co80Fe20 e Pd, 0,2 nm e 1 nm, respectivamente. A microscopia eletrônica revelou a altura total dos padrões magnéticos a ~18 nm(Figura 1B). Esta deposição multicamada FM única cria uma plataforma estável com anisotropia de magnetização perpendicular (.......

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Discussão

Os resultados representativos demonstram a eficácia da metodologia apresentada para controlar e organizar a formação da rede neuronal na escala de míccros. As células PC12 carregadas por MNP permaneceram viáveis e foram transformadas em unidades sensíveis magnéticas que foram atraídas pelas forças magnéticas dos eletrodos FM para locais específicos. Isso é melhor demonstrado na Figura 5C,onde as células preferencialmente aderiram aos vértices maiores dos hexágonos e não às linhas finas. Além.......

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Ministério da Ciência & Tecnologia, Israel, e pela Fundação israelense de Ciência (569/16).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução aquosa de paraformaldeído (formaldeído) a 16%ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES15710
Placa de cultura de células de 6 poçosFALCON353846
Placa de cultura de células de 96 poçosSPL life sciences30096
Solução de anfotericina BBiological Industries03-028-1B
AZ 1514H fotorresistenteMicroChemicals
AZ 351 B desenvolvedorMicroChemicals GmbH
Albumina de soro bovino (BSA)Biological Industries03-010-1B
Frasco de cultura de células e tecidosBiofilTCF00225075,0 cm^2 250 mL Tampa de ventilação, não tratada
Placa de cultura de célulasGreiner Bio-One627-160 Kit dede 35 mm
(baseado em XTT)Biological Industries20-300-1000
Tubo de centrífugaBiofilCFT02150050 mL
Co80Fe20 at% alvo de pulverização catódicaACI Alloys99.95%
Collagen tipo ICorning Inc.354236Cauda de rato, faixa de concentração 3-4 mg/mL
Microscópio confocalLeicaTCS SP5
Cy2-conjugado AffiniPure Donkey Anticorpo secundário anti-coelhoJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Agulha descartávelKDL23 G
Seringa descartável Medispo116022764010 mL
Soro de cavalo doadorBiological Industries04-124-1A
Leitor ELISAMerk MilliporeBioTek synergy 4 híbrido leitor de microplacas
Etanol 70%ROMICAL LTD19-009102-80
Etanol absoluto (Desidratado)Biolab-chemicals52505
Soro bovino fetal (FBS)Indústrias Biológicas04-127-1A
Eletroímã murino fresco β-NGFPeprotech450-34
GMW C-frame .Buckley systems LTD3470, 45 mm
Ácido clorídrico 32%DAEJUNG CHEMICAL & METALS4170-4100
ImageJUS National Institutes of Health, BethesdaNeuronJ plugin
Plasma indutivamente acoplado (ICP)Ametek SpectroSPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley fonte-medida Keithley2400
Keithley sistema de comutação Keithley3700
L-glutaminaBiological Industries03-020-1B
Microscópio ópticoLeicaDMIL LED
Fotolitografia sem máscaraHeidelberg Inst.MLA150
Microscópio SlidesBAR-NAORBN1042000C
Ácido nítrico 70%Sigma-Aldrich438073
Soro de burro normal (NDS)SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507 / 1LD
PC12 linha celularATCCCRL-1721
Pd alvo de pulverização catódicaACI ligas99,95%
Solução de penicilina-estreptomicina nistatinaBiological Industries03-032-1B
PrestoBlue reagente de viabilidade celularSondas molecularesA-13261à base de resazurina
para &alfa;-tubulinaSanta Cruz Biotechnology, Inc.
Sistema de pulverização catódica de magnetron RFOrion AJA Int.Orion 8
RPMI 1640 com l-glutaminaBiological Industries01-100-1A
Banho de sonicaçãoKUDOSSK3210HPFrequência: 53 kHz. Potência ultrassônica: 135 W
Magnetômetro SQUIDQuantum Design, CA
Triton X-100CHEM-IMPEXINTERNATIONAL 1279surfactante não iônico
XTT reagente
GmbH proliferação celular anticorpo de coelho de viabilidade celular

Referências

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of a....

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Reimpressões e permissões

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