Este trabalho apresenta uma abordagem de baixo para cima para a engenharia de forças magnéticas locais para o controle da organização neuronal. Células semelhantes a neurônios carregadas com nanopartículas magnéticas (MNPs) são banhadas no topo e controladas por uma plataforma micro-padronizada com magnetização perpendicular. Também são descritas caracterização magnética, captação celular MNP, viabilidade celular e análise estatística.
A capacidade de direcionar neurônios para redes neurais organizadas tem grandes implicações para medicina regenerativa, engenharia de tecidos e bio-interligação. Muitos estudos têm como objetivo direcionar neurônios usando pistas químicas e topográficas. No entanto, os relatos de controle organizacional em escala de micron sobre grandes áreas são escassos. Aqui, um método eficaz foi descrito para colocar neurônios em locais predefinidos e orientar o crescimento neuronal com resolução em escala de micron, usando plataformas magnéticas incorporadas com elementos magnéticos micro-padronizados. Foi demonstrado que carregar neurônios com nanopartículas magnéticas (MNPs) os converte em unidades magnéticas sensíveis que podem ser influenciadas por gradientes magnéticos. Após essa abordagem, uma plataforma magnética única foi fabricada na qual as células PC12, um modelo comum semelhante a neurônios, foram banhadas e carregadas com nanopartículas superparammagnéticas. Filmes finos de multicamadas ferromagnéticas (FM) com magnetização perpendicular estável foram depositados para fornecer forças de atração eficazes em direção aos padrões magnéticos. Estas células PC12 carregadas de MNP, banhadas e diferenciadas no topo das plataformas magnéticas, foram preferencialmente ligadas aos padrões magnéticos, e o crescimento de neurita estava bem alinhado com a forma de padrão, formando redes orientadas. São apresentados métodos quantitativos de caracterização das propriedades magnéticas, captação de MNP celular, viabilidade celular e análise estatística dos resultados. Essa abordagem permite o controle da formação da rede neural e melhora a interface neurônio-eletrodo através da manipulação de forças magnéticas, que pode ser uma ferramenta eficaz para estudos in vitro de redes e pode oferecer novas direções terapêuticas biointerfacing.
A micropatters de neurônios tem grande potencial para a regeneração tecidual1,2,3,4,5 e o desenvolvimento de dispositivos neuroeletráticos6,7,8. No entanto, o posicionamento em escala de micron de neurônios em alta resolução espacial, como nos tecidos biológicos, representa um desafio significativo. A formação de estruturas pré-escaladas nesta escala requer a orientação dos processos de células nervosas controlando localmente a soma motilidade e o crescimento axonal. Estudos anteriores sugeriram o uso de pistas químicas e físicas9,10,11,12 para orientar o crescimento neuronal. Aqui, uma nova abordagem se concentra no controle do posicionamento celular por gradientes de campo magnético13,14,15,16,17, transformando células carregadas com MNPs em unidades sensíveis ao magnético, que podem ser remotamente manipuladas.
Kunze et al., que caracterizaram a força necessária para induzir respostas celulares usando células magnéticas carregadas de chip e MNP, provaram que o alongamento axonal precoce pode ser desencadeado pela tensão mecânica dentro das células18. Tay et al. confirmaram que substratos micro-fabricados com gradientes de campo magnético aprimorados permitem a estimulação sem fio de circuitos neurais dosados com MNPs usando corantes indicadores de cálcio19. Além disso, Tseng et al. coalesced nanopartículas dentro das células, resultando em forças localizadas mediadas por nanopartículas que se aproximavam da tensão celular20. Isso levou à fabricação de padrões definidos de substratos micromagnéticos que ajudaram a estudar a resposta celular às forças mecânicas. A tensão celular decorrente da aplicação de forças localizadas mediadas por nanopartículas foi alcançada por nanopartículas de coalizão dentro das células20. Um sistema híbrido complementar de óxido de metal (CMOS) microfluidic foi desenvolvido por Lee et al. que incorporaram uma matriz de micro-eletroímãs no chip CMOS para controlar o movimento de células individuais marcadas com contas magnéticas21.
Alon et al. usaram almofadas magnéticas em microescala, pré-programadas como “pontos quentes” magnéticos para localizar células22. Atividade específica também poderia ser estimulada dentro de células usando matrizes magnéticas micro-padronizadas para localização de nanopartículas em locais subcelulares específicos23. A absorção de MNP celular foi demonstrada com sucesso nos neurônios primários de sanguessuga, rato e rato24,25,26. Aqui, isso foi demonstrado em uma linha celular de feocromocitoma pc12 rato, que foi relatado anteriormente para mostrar alta absorção de MNPs27. Nos últimos anos, houve diversas aplicações médicas de MNPs, incluindo entrega de medicamentos e termoterapia em tratamentos oncológicos28,29,30,31. Especificamente, os estudos tratam da aplicação de MNPs e redes de neurônios32,33,34,35. No entanto, a organização magnética de neurônios usando MNPs em um nível de célula única merece uma investigação mais aprofundada.
Neste trabalho, uma abordagem de baixo para cima foi descrita para projetar forças magnéticas locais através de plataformas pré-projetadas para controlar o arranjo neuronal. A fabricação de padrões em escala de micron de multicamadas FM foi apresentada. Esta estrutura multicamadas FM única cria magnetização perpendicular estável que resulta em forças de atração eficazes em direção a todos os padrões magnéticos. Via incubação, os MNPs foram carregados em células PC12, transformando-as em unidades sensíveis magnéticas. As células carregadas de MNP, banhadas e diferenciadas no topo das plataformas magnéticas, eram preferencialmente ligadas aos padrões magnéticos, e o crescimento de neurita estava bem alinhado com a forma de padrão, formando redes orientadas. Vários métodos foram descritos para caracterizar as propriedades magnéticas das multicamadas FM e dos MNPs, e técnicas de captação de MNP celular e ensaios de viabilidade celular também foram apresentadas. Além disso, parâmetros morfométricos de crescimento neuronal e análise estatística dos resultados são detalhados.
Os resultados representativos demonstram a eficácia da metodologia apresentada para controlar e organizar a formação da rede neuronal na escala de míccros. As células PC12 carregadas por MNP permaneceram viáveis e foram transformadas em unidades sensíveis magnéticas que foram atraídas pelas forças magnéticas dos eletrodos FM para locais específicos. Isso é melhor demonstrado na Figura 5C,onde as células preferencialmente aderiram aos vértices maiores dos hexágonos e não às …
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada pelo Ministério da Ciência & Tecnologia, Israel, e pela Fundação israelense de Ciência (569/16).
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15710 | |
6-well cell culture plate | FALCON | 353846 | |
96-well cell culture plate | SPL life sciences | 30096 | |
Amphotericin B solution | Biological Industries | 03-028-1B | |
AZ 1514H photoresist | MicroChemicals GmbH | ||
AZ 351 B developer | MicroChemicals GmbH | ||
Bovine serum albumin (BSA) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Cell and Tissue cultur flask | Biofil | TCF002250 | 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated |
Cell culture dish | Greiner Bio-One | 627-160 | 35 mm |
Cell Proliferation Kit (XTT-based) | Biological Industries | 20-300-1000 | |
Centrifuge tube | Biofil | CFT021500 | 50 mL |
Co80Fe20 at% sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
Collagen type I | Corning Inc. | 354236 | Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL |
Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-165-152 | |
DAPI fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Disposable needle | KDL | 23 G | |
Disposable syringe | Medispo | 1160227640 | 10 mL |
Donor horse serum | Biological Industries | 04-124-1A | |
ELISA reader | Merk Millipore | BioTek synergy 4 hybrid microplate reader | |
Ethanol 70% | ROMICAL LTD | 19-009102-80 | |
Ethanol absolute (Dehydrated) | Biolab-chemicals | 52505 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
Fresh murine β-NGF | Peprotech | 450-34 | |
GMW C-frame electromagnet . | Buckley systems LTD | 3470, 45 mm | |
Hydrochloric acid 32% | DAEJUNG CHEMICAL & METALS | 4170-4100 | |
ImageJ | US National Institutes of Health, Bethesda | NeuronJ plugin | |
Inductively coupled plasma (ICP) | Ametek Spectro | SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma | |
Keithley source-measure | Keithley | 2400 | |
Keithley switching system | Keithley | 3700 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Light microscope | Leica | DMIL LED | |
Maskless photolithography | Heidelberg Inst. | MLA150 | |
Microscope Slides | BAR-NAOR | BN1042000C | |
Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 438073 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma | D9663 | |
PBS 10x | hylabs | BP507/1LD | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Pd sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
Penicillin-streptomycin nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
PrestoBlue cell viability reagent | Molecular probes | A-13261 | resazurin-based |
Rabbit antibody to α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | ||
RF magnetron sputtering system | Orion AJA Int. | Orion 8 | |
RPMI 1640 with l-glutamine | Biological Industries | 01-100-1A | |
Sonication bath | KUDOS | SK3210HP | Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W |
SQUID magnetometer | Quantum Design, CA | ||
Triton X-100 | CHEM-IMPEX INTERNATIONAL | 1279 | non-ionic surfactant |
XTT cell viability reagent |