Lage, Dissektion und Analyse des Murin-Stellat-Ganglions
Summary
Pathophysiologische Veränderungen im kardialen autonomen Nervensystem, insbesondere in seinem sympathischen Zweig, tragen zum Auftreten und zur Aufrechterhaltung ventrikulärer Arrhythmien bei. Im vorliegenden Protokoll zeigen wir, wie murine Stellatganglien charakterisiert werden können, um das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen und zellulären Prozesse zu verbessern.
Abstract
Das vegetative Nervensystem ist ein wesentlicher Treiber der kardialen Elektrophysiologie. Insbesondere die Rolle seines sympathischen Zweiges ist eine laufende Untersuchungsfrage in der Pathophysiologie ventrikulärer Arrhythmien (VA). Neuronen in den Sternganglien (SG) – bilaterale sternförmige Strukturen der sympathischen Kette – sind ein wichtiger Bestandteil der sympathischen Infrastruktur. Die SG sind ein anerkanntes Ziel für die Behandlung über kardiale sympathische Denervierung bei Patienten mit therapierefraktärer VA. Während neuronaler Umbau und Gliaaktivierung im SG bei Patienten mit VA beschrieben wurden, sind die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Prozesse, die möglicherweise dem Auftreten von Arrhythmien vorausgehen, nur unzureichend verstanden und sollten zur Verbesserung der autonomen Modulation aufgeklärt werden. Mausmodelle ermöglichen es uns, sympathische neuronale Umbauten zu untersuchen, aber die Identifizierung des murinen SG ist für den unerfahrenen Forscher eine Herausforderung. So fehlen für viele häufige Herzerkrankungen vertiefte zelluläre und molekularbiologische Untersuchungen des murinen SG. Hier beschreiben wir ein grundlegendes Repertoire zur Sezierung und Untersuchung des SG bei erwachsenen Mäusen für Analysen auf RNA-Ebene (RNA-Isolierung für Genexpressionsanalysen, In-situ-Hybridisierung), Proteinebene (immunfluoreszierende Ganzkomountfärbung) und zelluläre Ebene (Basismorphologie, Zellgrößenmessung). Wir stellen mögliche Lösungen vor, um Herausforderungen in der Präparationstechnik zu meistern und die Färbung durch Abschrecken der Autofluoreszenz zu verbessern. Dies ermöglicht die Visualisierung von Neuronen sowie Gliazellen über etablierte Marker, um die Zellzusammensetzung und Umbauprozesse zu bestimmen. Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen die Charakterisierung des SG, um weitere Informationen über autonome Dysfunktion bei Mäusen zu gewinnen, die zu VA neigen, und können durch zusätzliche Techniken ergänzt werden, die neuronale und gliale Komponenten des autonomen Nervensystems im Herzen untersuchen.
Introduction
Das kardiale autonome Nervensystem ist ein streng reguliertes Gleichgewicht von sympathischen, parasympathischen und sensorischen Komponenten, das es dem Herzen ermöglicht, sich an Umweltveränderungen mit der entsprechenden physiologischen Reaktion anzupassen1,2. Störungen in diesem Gleichgewicht, zum Beispiel eine Zunahme der sympathischen Aktivität, wurden als Schlüsselfaktor für den Beginn sowie die Aufrechterhaltung von ventrikulären Arrhythmien (VA)3,4festgestellt. Daher ist die autonome Modulation, die durch pharmakologische Reduktion der sympathischen Aktivität mit Betablockern erreicht wird, seit Jahrzehnten ein Eckpfeiler in der Behandlung von Patienten mit VA5,6. Aber trotz pharmakologischer und katheterbasierter Interventionen leidet eine relevante Anzahl von Patienten immer noch an wiederkehrender VA7.
Der sympathische Input zum Herzen erfolgt meist über neuronale Zellkörper in den Sternganglien (SG), bilateralen sternförmigen Strukturen der sympathischen Kette, die Informationen über zahlreiche intrathorarakale Nerven vom Hirnstamm zum Herzen weiterleiten8,9,10. Nervenkeimen aus dem SG nach Verletzung ist mit VA und plötzlichem Herztod verbunden11,12, wobei das SG als Ziel für autonome Modulation13,14hervorgehoben wird. Eine Reduktion des sympathischen Inputs in das Herz kann vorübergehend durch perkutane Injektion von Lokalanästhetika oder dauerhaft durch teilweise Entfernung des SG mittels videogestützter Thorakoskopie erreicht werden15,16. Herzsympathische Denervierung stellt eine Option für Patienten mit therapierefraktärer VA mit vielversprechenden Ergebnissendar 14,16,17. Wir haben von explantierten SG dieser Patienten gelernt, dass neuronale und neurochemische Umbauten, Neuroentzündungen und Gliaaktivierung Kennzeichen des sympathischen Umbaus sind, der die autonome Dysfunktion beitragen oder verschlimmern kann18,19. Dennoch bleiben die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Prozesse in diesen Neuronen bis heute unklar, zum Beispiel die Rolle der neuronalen Transdifferenzierung in einen cholinergen Phänotyp20,21. Experimentelle Studien präsentieren neue Ansätze zur Behandlung von VA, zum Beispiel die Verringerung der sympathischen Nervenaktivität über die Optogenetik22, aber eine eingehende Charakterisierung des SG fehlt noch bei vielen Herzerkrankungen, die mit VA einhergehen. Mausmodelle, die diese Pathologien nachahmen, ermöglichen es, neuronale Umbauten zu untersuchen, die möglicherweise dem Auftreten von Arrhythmien vorausgehen12,23. Diese können durch weitere morphologische und funktionelle Analysen zur autonomen Charakterisierung des Herzens und des Nervensystems ergänzt werden. Im vorliegenden Protokoll stellen wir ein grundlegendes Repertoire an Methoden zur Verfügung, die es ermöglichen, das murine SG zu sezieren und zu charakterisieren, um das Verständnis von VA zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Verständnis zellulärer und molekularer Prozesse in Neuronen und Gliazellen des sympathischen Nervensystems, die dem Ausbruch der VA vorausgehen, ist von großem Interesse, da plötzlicher Herzstillstand weltweit die häufigste Todesursache bleibt5. Daher stellen wir im aktuellen Manuskript ein grundlegendes Repertoire an Methoden zur Verfügung, um das murine SG – ein murines Element innerhalb dieses Netzwerks – zu identifizieren und anschließend Analysen auf RNA-, Protein- und zellulä…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Hartwig Wieboldt für die hervorragende technische Unterstützung und der UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf für die Bereitstellung von Mikroskopen und Unterstützung. Diese Forschung wurde vom DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung) [FKZ 81Z4710141] gefördert.
Materials
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20×20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
Referências
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