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Medicina

뮤린 스텔레이트 갠리온의 위치, 해부 및 분석

Published: December 22, 2020
doi:
10.3791/62026
, , , , ,
1Division of Cardiology,EVK Düsseldorf, cNEP, cardiac Neuro- and Electrophysiology Research Consortium, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Institute of Neural and Sensory Physiology, Medical Faculty,Heinrich Heine University Düsseldorf, 4Clinic for Cardiology, University Heart & Vascular Centre,University Hospital Hamburg-Eppendorf, 5Department of Cardiology,Leiden University Medical Center

Summary

심장 자율 신경계의 병리학적 변화, 특히 교감 지점에서 심실 부정맥의 발병 및 유지 보수에 기여합니다. 본 프로토콜에서, 우리는 근본적인 분자 및 세포 프로세스의 이해를 향상시키기 위하여 murine stellate ganglia를 특성화하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

자율 신경계는 심장 전기 생리학의 실질적인 동인입니다. 특히 그 공감 분기의 역할은 심실 부정맥 (VA)의 병리 생리학에 있는 조사의 지속적인 문제입니다. 동정 사슬의 양측 별 모양 구조인 스텔레이트 신경리아(SG)의   뉴런은   공감 인프라의 중요한 구성 요소입니다. SG는 치료 내화 VA를 가진 환자에 있는 심장 교감 기질을 통해 처리를 위한 인정된 표적입니다. SG의 신경 리모델링 및 신경교 활성화는 VA 환자에서 설명되었지만, 잠재적으로 부정맥의 발병에 앞서 있는 근본적인 세포 및 분자 과정은 충분히 이해되지 않으며 자율 변조를 개선하기 위해 해명되어야 합니다. 마우스 모델은 우리가 공감 신경 리모델링을 연구 할 수 있습니다, 하지만 murine SG의 식별은 경험이 없는 조사자에게 도전이다. 따라서, 뮤린 SG의 심층 세포 및 분자 생물학적 연구는 많은 일반적인 심장 질환에 대한 부족하다. 여기서, RNA 수준(유전자 발현 분석을 위한 RNA 절연, 현장에서 혼성화), 단백질 수준(면역형성 전체 마운트 염색), 및 세포 수준(기본 형태학, 세포 크기 측정)에서 분석을 위해 성인 마우스에서 SG를 해부하고 연구하기 위한 기본 레퍼토리를 설명합니다. 우리는 준비 기술의 문제를 극복하기 위한 잠재적인 해결책과 자동 불발성 담금질을 통해 염색을 개선하는 방법을 제시합니다. 이를 통해 세포 조성 및 리모델링 과정을 결정하기 위해 확립된 마커를 통해 뉴런뿐만 아니라 신경교 세포의 시각화를 가능하게 한다. 여기에 제시된 방법은 SG가 VA에 걸리기 쉬운 마우스에 있는 자율 장애에 대한 추가 정보를 얻기 위하여 허용하고 심혼에 있는 자율 신경계의 신경 및 신경교 성분을 조사하는 추가 기술에 의해 보완될 수 있습니다.

Introduction

심장 자율 신경계는 심장이 적절한 생리적 반응1,2로환경 변화에 적응할 수 있도록 교감, 부교감 및 감각 성분의 엄격하게 조절된 평형이다. 이러한 평형의 교란은 예를 들어, 교감 활동의 증가, 발병의 핵심 동인으로서 확립된 뿐만 아니라 심실 부정맥(VA)3,4의유지보수로 확립되었다. 따라서, 베타 차단제와의 교감 활동의 약리학적 감소를 통해 달성된 자율 변조는 수십 년 동안 VA를 가진 환자의 치료에 초석이 되어왔다5,6. 그러나 약리학 및 카테터 기반 내정간섭에도 불구하고, 환자의 관련 수는 아직도 재발성 VA7때문에 손해를 입습니다.

심장에 대한 공감 입력은 주로 스텔레이트 신경리아(SG)의 신경 세포 체를 통해 중재되며, 교감 사슬의 양자 별 모양 구조는 뇌간에서 심장8,9,10까지수많은 내트라토라시크 신경을 통해 정보를 전달한다. 부상 후 SG로부터 발아하는 신경은 VA및 갑작스런심장사멸(11,12)과관련이 있으며, SG를 자율변조의 대상으로강조한다(13,14). 심장에 대한 공감 입력의 감소는 비디오 보조 흉부검사(15,16)를통해 SG를 부분적으로 제거함으로써 국소 마취제의 경피 주입또는 영구적으로 영구적으로 얻을 수 있다. 심장 동정 성 서성 검사는 유망한 결과 와 치료 불응성 VA 환자에 대한 옵션을 제공합니다14,16,17. 우리는 신경 및 신경 화학적 리모델링, 신경 염증 및 신경교 활성화가 자율 기능 장애18,19에기여하거나 악화 시킬 수있는 공감 리모델링의 특징이라는 이러한 환자의 이식 SG에서 배웠습니다. 여전히, 이러한 뉴런의 기본 세포 및 분자 과정은 현재까지 모호하게 남아, 예를 들어, 해저 현상형으로 뉴런 전이의 역할20,21. 실험 연구는 VA를 치료하는 새로운 접근 방식을 제시, 예를 들어, 광유전학을 통해 교감 신경 활동의 감소(22)하지만 SG의 심층 특성은 여전히 VA와 함께 가는 많은 심장 병리학에서 부족. 이러한 병리를 모방 마우스 모델은 잠재적으로 부정맥의 발병 앞에 신경 리모델링을 연구 할 수 있습니다12,23. 이들은 심혼과 신경계의 자율 특성화를 위한 추가 형태학 및 기능적인 분석에 의해 완료될 수 있습니다. 본 프로토콜에서, 우리는 VA의 이해를 향상시키기 위해 뮤린 SG를 해부하고 특성화 할 수있는 방법의 기본 레퍼토리를 제공합니다.

Protocol

동물과 관련된 모든 절차는 함부르크 주의 동물 관리 및 사용위원회 (ORG870, 959)와 자연, 환경 및 소비자 보호를위한 노스 라인 – 웨스트 팔리안 국가 기관 (LANUV, 07/11)에 의해 승인되었으며 국립 보건 원 (2011)에 준수합니다. 연구 결과는 당뇨병 자발적인 돌연변이를 위한 남성과 여성 (10-24주) C57BL/6 마우스(주식 번호 000664, 잭슨 연구소) 및 마우스 호모지구우스(db/db) 또는 이종화구우스(db/het; 대조군)?…

Representative Results

도 1은 SG를 식별하고 해부하는 방법을 시각화합니다. 도 1A는 위치의 회로도 도면을 나타내고, 도 1B는 심장 폐 패키지를 제거한 후 흉부로 뷰를 제시한다. SG와 늑골 케이지의 왼쪽 및 오른쪽 긴 콜리 근육은 방향에 중요한 랜드마크입니다. 해부는 근육과 첫 번째 갈비뼈 사이의 점선을 따라 수행됩니다. SG와 공감 체인은 흰색<strong…

Discussion

VA의 개시에 선행된 교감 신경계의 신경세포 및 분자 프로세스에 있는 세포 및 분자 프로세스의 이해는, 급격한 심장 정지가 전 세계적으로 죽음의 일반적인 원인 남아 있기 때문에, 높은 관심사입니다5. 따라서, 현재 원고에서, 우리는 뮤린 SG를 식별하는 방법의 기본 레퍼토리를 제공합니다 – 이 네트워크 내의 뮤린 원소 – RNA에 후속 분석을 수행, 단백질, 및 세포 수준.

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Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 그의 우수한 기술 지원에 대한 하트 위비히 Wieboldt 감사하고 싶습니다, 그리고 현미경및 지원을 제공하는 대학 의료 센터 함부르크 – Eppendorf의 UKE 현미경 이미징 시설 (Umif). 이 연구는 DZHK에 의해 투자되었다 (심장 혈관 연구를위한 독일 센터) [FKZ 81Z4710141].

Materials

96-well plate TPP 92097 RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mm R. Langenbrinck 03-0060 Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. Serva 11924.03 Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA B2261 Whole mount staining
Chicken anti neurofilament EMD Millipore AB5539 Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck, KGA, Darmstadt, Germany D8418 Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647  Merck, KGA, Darmstadt, Germany AP194SA6 Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568  Thermo Fisher Scientific A11057 Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488  Thermo Fisher Scientific A21206 Whole mount staining
Drying block 37-100 mm Whatman (Sigma Aldrich) WHA10310992  Whole mount staining
Eosin Y Sigma Aldrich E4009 Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) Th.Geyer 2212.5000 Whole mount staining
Eukitt mounting medium AppliChem 253681.0008 Whole mount staining
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPI Southern Biotech 0100-20 Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase EMD Millipore AP144P Whole mount staining
H2O2 30% (w/w) Merck, KGA, Darmstadt, Germany H1009 Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml Rotexmedica PZN: 3862340 Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kit Life technologies  4368813 RNA isolation
Isoflurane (Forene) Abbott Laboratories 2594.00.00 Preparation SG
Mayer's hemalum solution Merck 1.09249.0500 Whole mount staining
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Whole mount staining
Microscope cover glasses 20×20 mm or smaller Marienfeld 0101040 Whole mount staining
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 RNA isolation
NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000C RNA isolation
Opal 570 Reagent Pack Akoya Bioscience FP1488001KT RNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free  Alfa Aesar 43368 Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm Th.Geyer 7691202 Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets Gibco 18912-014 Whole mount staining
Pinzette Dumont SS Forceps FineScienceTools 11203-25 Preparation SG
QIAzol Lysis Reagent Qiagen  79306 RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Whole mount staining
RNAlater Merck R0901-100ML RNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 biotechne (ACD) 323100 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 biotechne (ACD) 431738-C2 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3 biotechne (ACD) 423391 RNAscope
Stainless steel beads 7 mm  Qiagen  69990 RNA isolation
Sudan black B Roth 0292.2 Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan mastermix Applied biosystems 4370074 Gene Expression analysis 
Tissue Lyser II Qiagen 85300 RNA isolation
Triton X-100 10% solution Sigma-Aldrich 93443-100ml Whole mount staining
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ML RNAscope
Wacom bamboo pen Wacom CTL-460/K Cell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 Sigma-Aldrich WHA10311647 Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate Thermo Fisher Scientific W21404 RNAscope
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Referências

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Keywords: Stellate GanglionSympathetic Nervous SystemCardiac NeurocontrolCardiac ArrhythmogenesisTyrosine HydroxylaseLongus Colli MuscleParaformaldehydeSudan BlackDense BleachAntibody Permeabilization
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Citar este artigo
Scherschel, K., Bräuninger, H., Glufke, K., Jungen, C., Klöcker, N., Meyer, C. Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion. J. Vis. Exp. (166), e62026, doi:10.3791/62026 (2020).
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