Оценка кристаллического содержания целлюлозы биомассы растений с использованием метода Updegraff

Summary

Метод Updegraff является наиболее широко используемым методом для оценки целлюлозы. Основная цель этой демонстрации заключается в предоставлении подробного протокола Updegraff для оценки содержания целлюлозы в образцах биомассы растений.

Abstract

Целлюлоза является наиболее распространенным полимером на Земле, генерируемым фотосинтезом и основным несущим компонентом клеточных стенок. Клеточная стенка играет значительную роль в росте и развитии растений, обеспечивая прочность, жесткость, скорость и направление роста клеток, поддержание формы клеток, а также защиту от биотических и абиотических стрессоров. Клеточная стенка в основном состоит из целлюлозы, лигнина, гемичеллозы и пектина. Недавно стенки клеток растений были ориентированы на производство биотоплива и биоэнергии второго поколения. В частности, целлюлозный компонент стенки клеток растения используется для производства целлюлозного этанола. Оценка содержания целлюлозы в биомассе имеет решающее значение для фундаментальных и прикладных исследований клеточной стенки. Метод Updegraff прост, надежн и наиболее широко используется метод для оценки кристаллического содержания целлюлозы биомассы растений. Алкоголь нерастворимых сырой фракции стенки клетки при лечении реагентом Updegraff устраняет гемичеллулозы и лигнина фракций. Позже, Updegraff реагент устойчивых целлюлозы фракция подвергается серной кислоты лечения гидролизов целлюлозы гомополимера в мономерных единиц глюкозы. Регрессионная линия разработана с использованием различных концентраций глюкозы и используется для оценки количества глюкозы, высвобождаемой при целлюлозном гидролизе в экспериментальных образцах. Наконец, содержание целлюлозы оценивается на основе количества мономеров глюкозы по колоритическому анализу антрона.

Introduction

Целлюлоза является основным нагрузоносным компонентом клеточных стенок, который присутствует как в первичных, так и в вторичных клеточных стенках. Клеточная стенка является внеклеточной матрицей, которая окружает растительные клетки и в основном состоит из целлюлозы, лигнина, гемицеллюлозы, пектина и матричных белков. Приблизительно одна треть биомассы растений целлюлозы^{1 и играет значительную роль} в росте и развитии растений, обеспечивая прочность, жесткость, скорость и направление роста клеток, поддержание формы клеток, а также защиту от биотических и абиотических стрессоров. Хлопковое волокно содержит 95% целлюлозы² содержание, в то время как деревья содержат от 40% до 50% целлюлозы в зависимости от видов растений и^{типов органов 3}. Целлюлоза состоит из повторяющихся единиц целлобиозы, дисахарид остатков глюкозы, соединенных β-1,4 гликозидионых^{связей 4}. Целлюлозный этанол производится из глюкозы, полученной из целлюлозы, присутствуют в стенках клеток растений⁵. Целлюлозное волокно состоит из нескольких микро фибрилляций, в которых каждый микро фибриллятор действует как основной блок с 500-15000 мономеров^{глюкозы 1,6}. Целлюлозный гомополимер синтезируется плазменной мембраной встроенных целлюлозно-синтазных комплексов (CSC’s)^1,7. Индивидуальные целлюлозные синтазы (CESA) белки синтезируют глюкановые цепи и прилегающие к ним глюкановые цепи соединены водородными связями для формирования кристаллической^{целлюлозы 1,8.} Целлюлоза существует в нескольких кристаллических формах с двумя преобладающими формами, целлюлозой I и целлюлозой I, как родные формы⁹. В высших растениях целлюлоза существует в форме целлюлозы I, в то время как нижняя целлюлоза растений существует в^{форме I q 10,11}. В целом, целлюлоза играет значительную роль в придав прочности и жесткости стенок клеток растений.

Биотопливо первого поколения в основном производится из кукурузного крахмала, тростникового сахара и свеклы сахаров, которые являются источниками пищи, в то время как биотопливо второго поколения фокусируется на производстве биотоплива из непродовольственных растений биомассы клеточный материал^{стены 12}. Точная оценка содержания кристаллической целлюлозы важна не только для фундаментальных исследований биосинтеза целлюлозы и динамики клеточных стенок, но и для прикладных исследований биотоплива и био продуктов. Разработаны и оптимизированы различные методы оценки целлюлозы в биомассе растений, а метод Ульдеграффа является наиболее широко используемым методом оценки целлюлозы. Первый зарегистрированный метод оценки целлюлозы был Кросс и Беван в 1908^{году 13}. Метод был основан на принципе альтернативного хлорирования и экстракции сульфатом натрия. Тем не менее, целлюлоза, полученная в оригинале, а также измененные протоколы Креста и Беван метод показал загрязнение небольших фракций лигнина в дополнение к значительному количеству ксиланов и маннан¹⁴. Несмотря на несколько изменений для удаления лигнина и гемичеллозы из целлюлозной фракции, метод Кросс-Беван сохранил значительное количество маннан вместе с целлюлозой. Позже метод Куршнера был разработан с использованием азотной кислоты и этанола для извлечения целлюлозы^15. Этот метод заявил, что общий лигнин и 75% пентозанов были удалены, но истинные результаты целлюлозы были такими же, как те, которые оцениваются методом хлорирования Креста и Бевана. Другой метод (Норман и Дженкинс) был разработан с использованием метанола-бензола, сульфата натрия и гипохлорита натрия для извлечения^{целлюлозы 16}. Этот метод также сохранил некоторую долю лигнина (3%) и значительное количество пентозанов, что приводит к точной оценке целлюлозы. Позже Кизель и Семигановский использовали другой подход к гидролизной целлюлозе, используя 80% концентрированной серной кислоты, а гидролизированные пониженные сахара оценивались методом^{Бертрана 17.} Два метода, Waksman и Стивенс^{18 и Сало 14},^{19, которые были разработаны} на основе метода Kiesel и Semiganowsky, также дали 4-5% меньше содержания целлюлозы по сравнению с предыдущими методами²⁰.

Метод Updegraff является наиболее широко используемым методом для оценки кристаллического содержания целлюлозы. Этот метод был впервые описан Updegraff для измерения целлюлозы в 1969^{году 21}. Метод Updegraff интегрирует метод Kurschner (использование азотной кислоты), методы Кизела и Семиновского (гидролиз целлюлозы в мономеры глюкозы с использованием серной кислоты) с некоторыми модификациями, и антронный анализ Viles и Silverman для простой колоритной оценки содержания глюкозы и^{кристаллической целлюлозы 22}. Принцип этого метода является использование уксусной кислоты и азотной кислоты (Updegraff реагент) для устранения гемичеллозы и лигнина из гомогенизированных тканей растений, что оставляет уксусной / азотной кислоты устойчивых целлюлозы для дальнейшей обработки и^{оценки 15}. Ацетическая/азотная кислотная устойчивая целлюлоза лечится 67% серной кислотой, чтобы разбить целлюлозу на мономеры^{глюкозы,}а выпущенные мономеры глюкозы оцениваются по анализу^21,23. Несколько модификаций оригинального метода Updegraff были использованы для упрощения процедуры и оценки целлюлозы с помощью анализа^24. В целом этот метод можно разделить на пять этапов. На первом этапе готовится растительный материал. На втором этапе стена сырой клетки отделяется от общей биомассы, так как целлюлоза является ключевым компонентом стенок клеток растений. Позже, в третьей фазе, целлюлоза отделяется от неклеточных компонентов клеточной стенки путем лечения реагентом Updegraff. В четвертой фазе устойчивая к уксусу/азотной кислоте целлюлоза разбита на мономеры глюкозы путем лечения серной кислотой. Серная кислота лечения целлюлозы приводит к образованию 5-гидроксиметилфурфальных соединений от реакции мономеров глюкозы с серной кислотой. Наконец, на последнем этапе, антрон генерирует зеленовато-голубой комплекс путем кипения с меховым соединением, генерируемым в предыдущей фазе²⁵. Этот цветометрический метод на основе антрона был впервые использован в 1942 году Дрейвудом. Антрон является красителем, который определяет меховые соединения пентозы и шестинозных обезвоженных продуктов, таких как 5-гидроксиметилфурфурурал, в кислых условиях. Реакция с шестиосной производит интенсивный цвет и лучший ответ по сравнению с пентозами²⁵. Количество связанной глюкозы измеряется абсорбации спектрофотометра на уровне 620 нм, а интенсивность зеленовато-голубого комплекса прямо пропорциональна количеству сахара в образце. Измеренные значения абсорбции сравнивались со стандартной линией регрессии кривой глюкозы для расчета концентрации глюкозы в образце. Измеренное содержание глюкозы было использовано для оценки содержания целлюлозы в биомассе растения.

Protocol

1. Экспериментальная подготовка Измельчить сушеный растительный материал в мелкий порошок. Белка Solubilization Buffer (PSB): Подготовка фондовых растворов 1 M Tris (рН 8,8), 0,5 М этилендиаминтетраатетической кислоты (EDTA) (рН 8,0) и автоклав их. Сделайте свежий буфер PSB из этих фондовых растворов ?…

Representative Results

Хлопковые растения, выращенные в зеленом доме, были отобраны для этого исследования. Для сравнительного анализа содержания целлюлозы были отобраны две различные экспериментальные линии хлопка. Для каждой экспериментальной линии корневая ткань была собрана из трех биологических репл…

Discussion

Хлопковые волокна являются натуральными волокнами, произведенными из хлопчатобумажного семе. Хлопковое волокно является одной клеткой с содержанием целлюлозы 95%^{2 с} высоким содержанием кристаллической целлюлозы с обширным применением в текстильной^{промышленно?…}

Materials

Acetone	Fisher Chemical	A18-500	Used in the protocol
Anthrone	Sigma Aldrich	90-44-8	For colorimetric assay
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifugation
Chloroform	Mallinckrodt	67-66-3	Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	6381-92-6	Used in the protocol
Ethanol	Millipore Sigma	EM-EX0276-4S	Used in the protocol
Filter paper	Whatman	1004-090	Positive control
Glacial acetic acid	Sigma	SKU A6283	Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5	Eppendorf	13527550	For controlled temperatures
Incubator	Fisherbrand	150152633	Used for drying plant sample
Measuring Scale	Mettler Toledo	30243386	For specific quantities
Methanol 100 %	Fisher Chemical	A412-500	Used in the protocol
Microplate (96 well)	Evergreen Scientific	222-8030-01F	For anthrone assay
Nitric acid	Sigma Aldrich	695041	Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes	BioSpec Products	10831	For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector)	Beckmancoulter DTX880	1000814	For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid	J.T.Baker	02-004-382	Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3	Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL)	Fisher Scientific	05-408-138	Used in the protocol
Tris Hydrochloride	Sigma Aldrich	1185-53-1	Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977	Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus)	Eppendorf	22820001	For drying samples
Vortex mixer	Fisherbrand	14-955-151	For mixing
Waterbath	Thermoscientific	TSGP02PM05	For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12A	Used in the protocol