Visualización Del SARS-CoV-2 Usando Inmuno ARN-Fluorescencia Hibridación In Situ
Summary
Aquí, describimos un método simple que combina el hibridación in situ de la fluorescencia del ARN (RNA-PESCADO) con la inmunofluorescencia para visualizar el ARN agudo severo del coronavirus 2 del coronavirus del síndrome respiratorio (SARS-CoV-2). Este protocolo puede aumentar la comprensión de las características moleculares de las interacciones ARN-huésped SARS-CoV-2 a nivel unicelular.
Abstract
Este manuscrito proporciona un protocolo para la reacción en cadena in situ del hibridación (HCR) juntada con inmunofluorescencia para visualizar el ARN agudo severo del coronavirus 2 del coronavirus (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo en variedades de células y culturas tridimensionales (3D) del epitelio humano de la vía aérea. El método permite la visualización altamente específica y sensible del ARN viral confiando en el HCR iniciado por la localización de la punta de prueba. Las sondas de iniciador dividido ayudan a amplificar la señal mediante amplificadores marcados fluorescentemente, lo que resulta en una fluorescencia de fondo insignificante en la microscopía confocal. El etiquetado de amplificadores con diferentes colorantes fluorescentes facilita el reconocimiento simultáneo de varios objetivos. Esto, a su vez, permite el mapeo de la infección en los tejidos para comprender mejor la patogénesis viral y la replicación a nivel unicelular. El acoplamiento de este método con la inmunofluorescencia puede facilitar una mejor comprensión de las interacciones huésped-virus, incluida la alternancia del epigenoma del huésped y las vías de respuesta inmune. Debido a la tecnología sensible y específica del HCR, este protocolo también se puede utilizar como herramienta de diagnóstico. También es importante recordar que la técnica puede modificarse fácilmente para permitir la detección de cualquier ARN, incluidos los ARN no codificantes y los virus de ARN que puedan surgir en el futuro.
Introduction
El SARS-CoV-2 es un nuevo betacoronavirus humano que surgió a finales de 2019, causando una pandemia sin precedentes unos meses después. Debido a que el virus es nuevo para la ciencia, gran parte de su biología y su impacto en las células huésped siguen siendo desconocidos. Por lo tanto, el mapeo del tropismo virus-célula y -tejido durante la infección es importante si se quieren entender sus características biológicas básicas y sus efectos sobre el huésped. Varias técnicas se utilizan para examinar la interacción virus-huésped incluyendo análisis bioquímicos, biológicos, y físicos. El hibridación in situ es un método común que emplea la DNA complementaria etiquetada, el ARN, o las puntas de prueba modificadas del ácido nucleico, que localizan a las secuencias específicas de la DNA o del ARN en una célula o un tejido.
Se ha desarrollado un nuevo método de hibridación in situ fluorescente de ARN (RNA-FISH) que incorpora modificaciones para aumentar la sensibilidad mediante la amplificación de la relación señal/ruido a través de un HCR1. HCR permite el estudio de la localización del ARN a nivel unicelular. Debido a su alta especificidad, sensibilidad y resolución, este método es útil no solo para estudios de ciencias básicas, sino también para proyectos de aplicación, por ejemplo, diagnósticos. Recientemente, se demostró la viabilidad de este método para la detección de ARN del SARS-CoV-2 localizado en células ciliadas dentro de cultivos de epitelio de vía aérea humana (AE) 3D totalmente diferenciados2. Los cultivos de AE constituyen una de las herramientas más avanzadas utilizadas para estudiar la infección viral en el contexto del microambiente de “infección natural”3,4.
Varios informes sobre coronavirus humanos (HCoV), incluido el SARS-CoV-2, destacan la importancia de las modificaciones epigenéticas con respecto a la infección por HCoV y la fisiopatología [revisada en 5],por ejemplo, el patrón de metilación del gen que codifica el receptor de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE-2)6,7. Curiosamente, el cribado espectrométrico de masas identificó varios factores epigenéticos que interactúan con el proteoma SARS-CoV-28. Más específicamente, la proteína no estructural 5 (NSP5) se une al regulador epigenético, la histona desacetilasa 2, y la NSP5 catalíticamente inactiva (C145A) interactúa con la ARNt metiltransferasa 1 (24). Además, la actividad de la metiltransferasa NSP16 es bloqueada por el inhibidor de la metiltransferasa, la sinefungina9. Sin embargo, el papel exacto de estos factores epigenéticos en el COVID-19 sigue sin estar claro. La replicación del VHCo tiene lugar en el citoplasma de la célula infectada, y desencadena respuestas inflamatorias que son reguladas por modificaciones epigenéticas10.
Por ejemplo, HCoV-229E ajusta la señalización nuclear del factor-kappa B y reprograma profundamente el paisaje de la cromatina celular del huésped aumentando la acetilación de H3K36 y H4K5 en ciertas regiones11. La infección por coronavirus relacionada con el síndrome respiratorio de Oriente Medio aumenta los niveles de H3K27me3 y agota el H3K4me3 en las regiones promotoras de subconjuntos de genes específicos sensibles al interferón12. Además, el ARN viral desencadena respuestas inmunitarias celulares, como se ha demostrado para los flavivirus13,retrovirus14,15y coronavirus16. Los marcadores epigenéticos en el ARN viral pueden desempeñar un papel en el reconocimiento por los sensores celulares, como se muestra para la metilación m7A del ARN 17 del virus de la inmunodeficienciahumana-1. Sin embargo, quedan preguntas: ¿Cuál es el impacto del ARN del SARS-CoV-2 en la respuesta inmune, y están involucradas las marcas epigenéticas?
Aquí, un método optimizado del ARN-PESCADO juntado con el análisis de la inmunofluorescencia de variedades de células y de tejidos 3D (HAE totalmente distinguido) se ha descrito. Aunque los métodos citológicos, como fish e inmunofluorescencia, se utilizan ampliamente, este método de hibridación in situ de nueva generación basado en el HCR nunca se ha utilizado para la detección de virus (excepto en una publicación reciente)2. En general, la inmunotensación y fish requieren los siguientes pasos: permeabilización para permitir la penetración de sondas o anticuerpos; fijación en la que el material celular se fija y se conserva; detección en la que se aplican anticuerpos o sondas de ácido nucleico; y por último, montaje de las muestras para su visualización.
Aunque los protocolos existentes comparten estas características generales, varían notablemente con respecto a los parámetros implicados. Aquí, un protocolo optimizado, simple, inmuno-ARN-FISH se ha descrito para detectar el ARN sars-CoV-2 en cultivos de AE y células Vero. La técnica comprende los pasos siguientes: (1) fijación de células con paraformacionaldehído; (2) permeabilización con detergente o metanol (MeOH); (3) rehidratación a través de una serie graduada de soluciones MeOH (cultivos AE solamente); (4) detección; (5) amplificación utilizando la tecnología HCR para detectar el ARN del SARS-CoV-2; (6) immunostaining; y (7) proyección de imagen debajo de un microscopio confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-RNA-FISH es un método confiable para la doble-coloración del ARN y de las proteínas celulares. Aquí, se ha descrito un protocolo modificado de inmuno-ARN-FISH que permite la detección de ARN sars-CoV-2 y proteínas celulares en líneas celulares y cultivos de AE. Este protocolo se puede adaptar para su uso en diferentes modelos celulares, incluyendo monocapas celulares o tejidos específicos. El método se basa en el concepto de un HCR iniciado por la localización apropiada de la sonda. A continuación, el u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Educación Superior para la investigación sobre el SARS-CoV-2, y por subvenciones del Centro Nacional de Ciencias (subvenciones UMO2017/27/B/NZ6/02488 a K.P. y UMO-2018/30/E/NZ1/00874 a A.K.-P.).
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
Referências
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