Aqui, descrevemos um método simples que combina fluorescência de RNA na hibridização situ (RNA-FISH) com imunofluorescência para visualizar síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Este protocolo pode aumentar a compreensão das características moleculares das interações sars-cov-2 RNA-host em um nível de célula única.
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Artigo de método
Visualização de SARS-CoV-2 usando Imuno RNA-Fluorescence In Situ Hibridização
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este manuscrito fornece um protocolo para reação em cadeia de hibridização in situ (HCR) juntamente com a imunofluorescência para visualizar a síndrome respiratória aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA na linha celular e culturas tridimensionais (3D) do epitélio das vias aéreas humanas. O método permite uma visualização altamente específica e sensível do RNA viral, contando com o HCR iniciado pela localização da sonda. As sondas de iniciação dividida ajudam a amplificar o sinal por amplificadores fluorescentes rotulados, resultando em fluorescência de fundo insignificante na microscopia confocal. A rotulagem de amplificadores com diferentes corantes fluorescentes facilita o reconhecimento simultâneo de vários alvos. Isso, por sua vez, permite o mapeamento da infecção nos tecidos para entender melhor a patogênese viral e a replicação no nível unicelular. Acoplamento deste método com imunofluorescência pode facilitar uma melhor compreensão das interações hospedeiro-vírus, incluindo a alternância das vias de epigenome hospedeiro e resposta imune. Devido à tecnologia de HCR sensível e específica, este protocolo também pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico. Também é importante lembrar que a técnica pode ser modificada facilmente para permitir a detecção de qualquer RNA, incluindo RNAs não codificadas e vírus RNA que possam surgir no futuro.
Introdução
SARS-CoV-2 é um novo betacoronavírus humano que surgiu no final de 2019, causando uma pandemia sem precedentes alguns meses depois. Como o vírus é novo na ciência, grande parte de sua biologia e seu impacto nas células hospedeiras permanecem desconhecidos. Portanto, mapear o tropismo de células vírus e tecidos durante a infecção é importante para que suas características biológicas básicas e seus efeitos sobre o hospedeiro sejam compreendidos. Várias técnicas são usadas para examinar a interação entre vírus, incluindo ensaios bioquímicos, biológicos e físicos. A hibridização in situ é um método comum que emprega dna complementar rotulado, RNA ou sondas de ácido nuclei....
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Protocolo
1. Preparação do buffer
- Para 500 mL de tampão PHEM 2x, combinar 18,14 g de piperazina-N,N′-bis(2-ácido elfônico) (PIPES), 6,5 g de 4-(2-hidroxitila)-1-piper Ácido esulfônico de eazina (HEPES), 3,8 g de ácido tetraacético etileno glicol (EGTA) e 0,99 g de sulfato de magnésio (MgSO4). Faça o volume até ~400 mL com água destilada (dH2O), mexa e ajuste o pH para 7,0 usando hidróxido de potássio de 10 M (KOH) ou hidróxido de sódio (NaOH). Faça o volume final até 500 mL e, em seguida, divida em alíquotas de 50 mL. Armazenar a -20 °C até que seja necessário.
NOTA: O buffer não estará claro até que o pH atinja 7,0. - Prepare....
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Resultados
O protocolo imuno-RNA-FISH descrito neste manuscrito foi realizado utilizando dois sistemas celulares: uma linha celular Vero e uma cultura 3D HAE. Os principais passos para ambos os modelos celulares são mostrados na Tabela 2. O protocolo RNA-FISH para visualização de SARS-CoV-2 nas culturas HAE inclui etapas típicas para amostras de tecido, ou seja, permeabilização com 100% meOH e reidratação através de uma série classificada de soluções MeOH-PBS e 0,1% Tween. A imunofl.......
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Discussão
O Imuno-RNA-FISH é um método confiável para coloração dupla de RNA e proteínas celulares. Aqui, foi descrito um protocolo modificado de imuno-RNA-FISH que permite a detecção de RNA SARS-CoV-2 e proteínas celulares em linhas celulares e culturas HAE. Este protocolo pode ser adaptado para uso em diferentes modelos celulares, incluindo monocamadas celulares ou tecidos específicos. O método se baseia no conceito de um HCR iniciado pela localização adequada da sonda. Em seguida, o uso de sondas de iniciação dividida para inic.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Educação Superior para pesquisa sobre SARS-CoV-2, e por bolsas do Centro Nacional de Ciência (bolsas UMO2017/27/B/NZ6/02488 a K.P. e UMO-2018/30/E/NZ1/00874 a A.K.-P.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipamento | |||
| Microscópio Confocal LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker-Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubadora Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materiais | |||
| 15 mm x 15 mm N.º 1 lamínulas | LabSolute | 7695022 | |
| tubos de 1,5 | mL FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| Placa de 12 poços | TTP | 92412 | |
| Tubo de centrífuga cónico | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilme | Sigma | P7793-1EA | |
| pipetas serológicas | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| vidro deslizante | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagentes | |||
| Alexa fluoróforo 488-conjugado anticorpos secundários | Invitrogen | ||
| β 5-tubulina | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Fosfato dissódico | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | O tampão também pode ser preparado doi:10.1242/dev.165753: Informações suplementares |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | ||
| amplificador HCR B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | ||
| HCR Sonda Hibridização Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | tampão também pode ser preparado doi:10.1242/dev.165753: Informações suplementares |
| Conjunto de sonda HCR para SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Sonda Tampão de Lavagem | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Tampão também pode ser preparado doi:10.1242/dev.165753: Informações complementares |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Sulfato de magnésio heptahidratado | Sigma | 63138-250G | |
| Metanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Fosfato monopotássico | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldeído | Sigma | P6148-1KG | |
| TUBOS | BioShop | PIP666.100 | |
| Cloreto de Potássio | Sigma | P5405-250G | |
| Prolongar Diamante Antifade Meio de Montagem | Invitrogen | P36970 | |
| Cloreto de Sódio | BioShop | SOD001.5 | |
| Citrato Trissódico 2-hidrato | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | Software | ||
Referências
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al.
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Reimpressões e permissões
