시투 혼성화에서 면역 RNA-형광을 이용한 SARS-CoV-2의 시각화
Summary
여기서, 우리는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) RNA를 시각화하기 위하여 정시 혼성화 (RNA-FISH)와 면역형광에 있는 RNA 형광을 결합하는 간단한 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 SARS-CoV-2 RNA 숙주 상호 작용의 분자 특성에 대한 이해를 증가시킬 수 있다.
Abstract
본 원고는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) RNA를 인간 기도 상피의 3차원(3D) 배양으로 시각화하기 위해 면역형광과 결합된 시상 혼성화 연쇄 반응(HCR)에서 프로토콜을 제공한다. 이 방법은 프로브 국소화에 의해 시작된 HCR에 의존하여 바이러스 RNA의 매우 구체적이고 민감한 시각화를 허용합니다. 분할 시이터 프로브는 형광으로 표지된 증폭기로 신호를 증폭시켜 공초점 현미경 검사법의 무시할 수 있는 배경 형광을 초래합니다. 다양한 형광염료를 가진 앰프를 라벨링하면 다양한 표적을 동시에 인식할 수 있습니다. 이것은, 차례차례로, 단세포 수준에서 바이러스성 병인 및 복제를 더 잘 이해하기 위하여 조직에 있는 감염의 매핑을 허용합니다. 면역 형광과 이 방법을 결합하면 숙주 후성 유전체 및 면역 반응 경로의 교대를 포함하여 숙주 바이러스 상호 작용에 대한 더 나은 이해를 촉진 할 수 있습니다. 민감하고 구체적인 HCR 기술 덕분에 이 프로토콜을 진단 도구로도 사용할 수 있습니다. 또한 미래에 나타날 수 있는 비코딩 RNA 및 RNA 바이러스를 포함하여 임의의 RNA의 검출을 가능하게 하기 위하여 기술이 쉽게 수정될 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
Introduction
SARS-CoV-2는 2019년 말에 등장한 새로운 인간 베타코로나바이러스로, 몇 달 후 전례 없는 전염병을 일으켰습니다. 바이러스는 과학에 새로운 때문에, 그것의 생물학및 호스트 세포에 그것의 충격의 대부분은 알려지지 않은 남아 있습니다. 따라서, 감염 시 바이러스 세포 및 조직 트트로피를 매핑하는 것은 그것의 기본적인 생물학적 특성 및 호스트에 대한 그 효력이 이해되어야 하는 경우에 중요합니다. 몇몇 기술은 생화학, 생물학 및 물리적 분석을 포함하여 바이러스 호스트 상호 작용을 검토하기 위하여 이용됩니다. 시상 혼성화는 세포 또는 조직에서 특정 DNA 또는 RNA 서열에 국한되는 표지된 상보DNA, RNA 또는 변형된 핵산 프로브를 사용하는 일반적인 방법입니다.
신분 혼성화(RNA-FISH) 방법의 새로운 RNA 형광은 HCR1을통해 신호 대 잡음 비율을 증폭시킴으로써 감도를 높이기 위한 변형을 통합하는 것으로 개발되었다. HCR은 단세포 수준에서 RNA 현지화의 연구를 허용합니다. 높은 특이성, 감도 및 해상도로 인해 이 방법은 기초 과학 연구뿐만 아니라 진단과 같은 적용 프로젝트에도 유용합니다. 최근에는, 본 방법의 타당성은 완전히 분화된 3D 인간기도 상피(HAE) 배양2내의 섬모 세포에 국소화된 SARS-CoV-2 RNA를 검출하기 위한 것이 입증되었다. HAE 배양은 “자연 감염” 마이크로환경3,4의맥락에서 바이러스 감염을 연구하는 데 사용되는 가장 진보된 도구 중 하나를구성한다.
SARS-CoV-2를 포함한 인간 코로나바이러스(HCoV)에 대한 여러 보고서는 HCoV 감염 및 병리학에 대한 후성유전학적 변형의 중요성을 강조합니다[5], 예를 들어, 안지오텐신 변환 효소 2(ACE-2) 수용체2를코딩하는 유전자의 메틸화 패턴, 예를 들어, 후성유전학적 변형의중요성을강조한다. 흥미롭게도, 질량 분광 스크리닝 은 SARS-CoV-2 proteome 8과 상호 작용하는 몇몇 후성 유전학 요인을확인했습니다. 보다 구체적으로, 비구조적 단백질 5(NSP5)는 후생유전학 적 레귤레이터에 결합하고, 히스톤 deacetylase 2, 및 촉매비활성 NSP5(C145A)는 tRNA 메틸트랜스퍼라제 1(24)과 상호작용한다. 또한, NSP16 메틸트랜스퍼효소 활성은 메틸트랜스퍼효소 억제제, 시네풍진9에의해 차단된다. 그러나, COVID-19에 있는 이 후성유전학 요인의 정확한 역할은 불분명합니다. HCoV의 복제는 감염된 세포의 세포질에서 일어나고, 후성 유전학 수정에 의해 조절되는 염증 반응을트리거10.
예를 들어, HCoV-229E 미세 조정 핵 인자-카파 B 시그널링 및 특정 지역에서 H3K36 및 H4K5의 아세틸화를 증가시켜 호스트 셀룰러 크로마틴 풍경을 심오하게 재프로그램11. 중동 호흡기 증후군 관련 코로나바이러스 감염은 H3K27me3의 수준을 증가시키고 특정 인터페론 에민감한 유전자의 서브세트의 프로모터 영역에서 H3K4me3을고갈시킨다(12). 또한, 바이러스 RNA는플라비바이러스(13),레트로바이러스14,15,및 코로나바이러스(16)에 대해 입증된 바와 같이 세포 면역 반응을 유발한다. 바이러스 RNA에 후성 유전학 마커는 인간 면역 결핍 바이러스-1 RNA17의m7A 메틸화에 대해 도시된 바와 같이 세포 센서에 의해 인식에 역할을 할 수 있다. 그러나, 질문은 남아 있습니다: 면역 반응에 SARS-CoV-2 RNA의 충격은 무엇이며, 후성 유전학 표시는 관련되습니까?
여기서, 세포주 및 3D 조직의 면역형광 분석과 결합된 최적화된 RNA-FISH 방법(완전히 분화된 HAE)이 설명되고 있다. FISH 및 면역형광과 같은 세포학적 방법이 널리 사용되지만, HCR을 기반으로 한 시상 혼성화 방법의 이 신세대는 바이러스 검출에 사용된 적이 없다(최근 간행물을 제외하고)2. 일반적으로 면역 염색 및 FISH는 다음과 같은 단계를 필요로 합니다: 프로브 또는 항체의 침투를 가능하게 하기 위하여 투과성; 셀룰러 물질이 고정되고 보존되는 고정; 항체 또는 핵산 프로브가 적용되는 검출; 마지막으로 시각화를 위한 샘플 장착.
기존 프로토콜은 이러한 일반적인 기능을 공유하지만 관련된 매개 변수와 관련하여 현저하게 다릅니다. 여기서, 최적화된, 간단한, 면역 RNA-FISH 프로토콜은 HAE 배양 및 베로 세포에서 SARS-CoV-2 RNA를 검출하기 위하여 기술되었다. 기술은 다음과 같은 단계를 포함한다: (1) 파라포름알데히드를 가진 세포의 고정; (2) 세제 또는 메탄올과 과구 (MeOH); (3) 등급이 매겨진 일련의 MeOH 솔루션을 통한 재수화(HAE 배양만); (4) 검출; (5) HCR 기술을 이용하여 증폭하여 SARS-CoV-2 RNA를 검출하는; (6) 면역 염색; 및 (7) 공초점 현미경의 밑에 화상 진찰.
Protocol
Representative Results
Discussion
면역 RNA-FISH는 RNA 와 세포 단백질의 이중 염색을 위한 신뢰할 수 있는 방법입니다. 여기서, 변형된 면역-RNA-FISH 프로토콜은 세포주 및 HAE 배양에서 SARS-CoV-2 RNA 및 세포단백질의 검출을 가능하게 하는 것으로 기술되었다. 이 프로토콜은 세포 단층 또는 특정 조직을 포함하는 다른 세포 모형에서 사용하기 위하여 적응될 수 있습니다. 이 방법은 적절한 프로브 현지화로 시작된 HCR의 개념에 의존합니다…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 SARS-CoV-2에 대한 연구를 위해 과학 고등 교육부에 의해 지원되었으며 국립 과학 센터 (UMO2017/27 /B / NZ6 /02488에서 K.P.와 UMO-2018/E/NZ1/00874 ~ A.K.K.P.의 보조금)을 지원했습니다.
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
Referências
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