근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토
Summary
골격 근 재생 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동, 근육 이영양증 등 많은 근육 질환에서 손상 되는, 그리고이 재생 하는 근육의 무능력 결과. 여기서는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사할 수 있는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
골격 근은 의무 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동 되는 부상 다음 재생 하는 놀라운 능력을 가지고. 부상 후, 근육 줄기 세포는 활성화 하 고 myoblasts의 풀을 생성 하는 세포 증식을 겪고, 이후 새로운 근육 섬유를 형성 하기 위해 분화. 많은 근육 낭비 조건에서, 근육 이영양증과 노화를 포함 하 여, 이 과정은 재생 하는 근육의 무능력의 결과 손상. 제브라피시의 근육 재생 과정은 근육 이영양증과 같은 근육 낭비 조건에서 근육 줄기 세포 기능 및 재생을 연구할 수 있는 우수한 시스템을 제공하는 포유류 시스템과 매우 잘 보존됩니다. 여기서는 근육질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사하는 방법을 제시한다. 첫 번째 단계는 상해를 유도하기 전에 애벌레의 유전자형의 결정을 허용하는 유전자속 플랫폼의 사용을 포함합니다. 유전자형을 결정한 후, 근육은 바늘 찌르기를 사용하여 부상을 입고, 그 다음에는 편광 광 현미경 검사가 근육 재생의 정도를 결정하는 데 사용된다. 따라서 우리는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생의 검사를 할 수있는 높은 처리량 파이프 라인을 제공합니다.
Introduction
골격 근은 인체 질량의 30-50%를 차지하며, 운동에 필수적일 뿐만 아니라 중요한 대사 및 저장 기관1의역할을 한다. 미예임에도 불구하고, 골격 근은 매우 역동적이며 부상 후 엄청난 재생 능력을 유지합니다. 이는 조직상상줄기세포(위성세포라고도 함)의 존재에 기인하며, 근섬유의 기저라미나 아래에 위치하며, 전사인인에 의해 박스 단백질 7(pax7) 및/또는 페어링된 상자 단백질 3(pax3) 등 2,3. 부상 후, 위성 세포는 활성화 되고 myoblasts의 풀을 생성 하기 위해 세포 증식을 겪고, 이후 새로운 근육 섬유를 형성 하기 위해 분화. 위성 세포 활성화및 견고한 근육 수리를 조절하는 프로 재생 신호의 고도로 보존된 폭포는 근막병증 및 동종성 노화4,5와같은 다양한 조건에서 영향을 받습니다.
이러한 다양한 근막병증 중 하나는 근육 이영양증으로, 진보적인 근육 낭비와 변성을 특징으로한다 6. 이들 질환은 비스트로핀과 라미닌-α2(LAMA2)를 포함한 주요 단백질의 유전적 돌연변이의 결과이며, 세포외 매트릭스7,8에근육 섬유를 부착하는 데 책임이 있다. 근육 이영양증에 연루된 단백질이 근육 구조를 유지하는 데 있어 이러한 중심적인 역할을 한다는 점을 감안할 때, 수년 동안 이 과정의 실패는 질병 병인9에대한 메커니즘이라고 여겨졌다. 그러나, 최근 연구는 근이영양증10,11에서관찰된 근육 병리학에 대한 두 번째 가능한 기초로서 근육 줄기 세포의 조절 및 근육 재생의 후속 장애에 결함을 확인하였다. 이와 같이, 추가 연구는 근육 줄기 세포 기능 및 관련 된 틈새 요소에 장애 근육 이영양증에 기여 하는 방법을 조사 하는 데 필요한.
지난 10년 동안제브라피쉬(다리오 리오)는질병 모델링12를위한 중요한 척추동물 모델로 떠올랐다. 이것은 제브라피시 태아의 급속한 외부 발달에 기인합니다, 그것의 광학 선명도와 결합하여, 근육 형성의 직접적인 가시화를 허용하는, 성장 및 기능. 또한, 제브라피시에 보존되는 근육의 발달과 구조뿐만 아니라, 또한 근육 재생의 매우 보존된 과정을표시한다 13. 따라서, 제브라피쉬는 근육 질환의 병리학을 연구하고 근육 재생이 어떻게 영향을 받는지 탐구하는 훌륭한 시스템을 나타냅니다. 이를 위해, 우리는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 골격 근육 재생의 적시 연구를 가능하게하는 방법을 개발했다. 이 높은 처리량 파이프라인은 바늘 찌르기 부상이 수행되고 근육 재생의 정도가 편광 광 현미경을 사용하여 이미지되는 다음 인멸형 살아있는배아(14)를유전자형으로 하는 방법을 포함한다. 이 기술의 활용은 그러므로 근육 질병의 제브라피시 모형에 있는 근육의 재생 능력을 드러낼 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
골격 근 재생 의무 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동, 그의 기능은 근육 이영양증 등 많은 근육 질환에서 변경, 이후 근육 재생의 과정을 방해. 여기에서, 우리는 근육 질병의 살아있는 제브라피시 모형에 있는 근육 재생을 검토하기 위하여 높은 처리량 프로토콜을 기술합니다. 파이프라인의 첫 번째 단계는 하류 재생 분석법을 수행하기 전에 살아있는 유충의 유전자형을 결정하는 사용자 친?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 현미경 유지 보수 및 설치에 대한 도움을 알렉스 풀처 박사와 모나시 마이크로 이미징에게 감사드립니다. 호주 재생 의학 연구소는 빅토리아 주 정부와 호주 정부의 보조금에 의해 지원됩니다. 이 작품은 근이영양증 협회 (미국) P.D.C (628882)에 프로젝트 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
Referências
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).
- Emery, A. E. H. . Duchenne muscular dystrophy. , (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
