オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル
Summary
ここでは、腸管バリア機能、透過性、および輸送を研究するためのヒトオルガノイド由来腸上皮単層の調製について述べる。オルガノイドは外部刺激に対する元の上皮組織応答を表すので、これらのモデルは細胞株の拡張性の利点と初代組織の関連性と複雑さを兼ね備えています。
Abstract
過去には、腸上皮モデル系は形質転換細胞株および初代組織に限定されていた。これらのモデル系は、前者が元の組織生理学を忠実に表していないため、固有の限界があり、後者の利用可能性は限られている。したがって、それらの適用は基礎的および医薬品開発研究を妨げる。成体幹細胞ベースのオルガノイド(以下、オルガノイドと呼ぶ)は、それらが由来する正常または罹患した上皮組織のミニチュアである。それらは、異なる胃腸(GI)管領域から非常に効率的に確立することができ、長期的な拡張性を有し、インビトロでの治療に対する組織および患者特異的応答をシミュレートすることができる。ここでは、腸管オルガノイド由来上皮単層の確立が、上皮バリアの完全性、透過性および輸送、抗菌タンパク質分泌、ならびに組織学を測定する方法とともに実証されている。さらに、腸管オルガノイド由来単層は、増殖する幹およびトランジット増幅細胞、ならびに重要な分化上皮細胞で富化することができる。したがって、それらは、標的細胞およびそれらの作用機序に対する化合物の効果を研究するために調整することができるモデル系を表す。オルガノイド培養は、いったん確立されると、細胞株よりも技術的に要求が厳しいですが、生体内上皮の複雑さと患者間の不均一性を真に表すため、医薬品開発の後期段階での失敗を減らすことができます。
Introduction
腸上皮は、腸の管腔内容物と下層組織との間の物理的障壁として作用する。この障壁は、タイトジャンクションによって接続された主に吸収性腸細胞の単一の上皮層を含み、隣接する細胞間の強力な細胞間接続を確立する。これらの細胞は、腸の頂端(管腔)側と側底側を分離する分極上皮ライニングを形成し、同時に消化された栄養素および代謝産物の傍細胞輸送を調節する。腸細胞に加えて、ゴブレット、パネス、および腸内分泌細胞などの他の重要な上皮細胞も、それぞれ粘液、抗菌ペプチド、およびホルモンを産生することによって腸の恒常性に寄与する。腸上皮は、ロイシンに富む反復含有Gタンパク質共役型受容体5陽性(LGR5+)幹細胞を腸陰窩の底部で分裂させることによって絶えず補充され、上方に移動して他の細胞型に分化するトランジット増幅(TA)細胞を産生する1。食物アレルゲン、薬効化合物、微生物病原体への曝露などの遺伝的および環境的要因による腸上皮恒常性の破壊は、腸のバリア機能の破壊につながる。これらの状態は、炎症性腸疾患(IBD)、セリアック病、および薬物誘発性GI毒性を含むいくつかの腸疾患を引き起こす2。
腸上皮に関する研究は、膜挿入物、臓器オンチップシステム、ウッシングチャンバー、腸リングなどのいくつかのin vitroプラットフォームシステムを使用して行われます。これらのプラットフォームは、形質転換細胞株または一次組織をモデルとして使用して、膜の頂端側および側底側の両方にアクセスする分極上皮単層を確立するのに適している。結腸直腸(アデノ)癌細胞株Caco-2、T84、HT-29などの形質転換細胞株は、分極腸腸細胞または粘液産生細胞にある程度分化することができるが、いくつかの細胞型が欠落しており、様々な受容体およびトランスポーターが異常に発現しているため、in vivo上皮を代表するものではない3.さらに、細胞株は単一のドナーに由来するため、患者間の不均一性を表すものではなく、複雑さと生理学的関連性の低下に苦しんでいます。Ussingチャンバーおよび腸管輪として使用される一次組織は、in vivo状況をより代表的ですが、それらの限られた可用性、短期的な生存率、および拡張性の欠如により、ハイスループット(HT)研究の媒体としては不適切です。
オルガノイドは、腸、腎臓、肝臓、膵臓、肺などの異なる器官から確立されたインビトロ上皮培養物である。それらは、長期的で安定した拡張性ならびに遺伝的および表現型の安定性を有することが証明されており、したがって、外部刺激に対する忠実な応答を有する元の器官の上皮の代表的な生物学的ミニチュアである4,5,6,7,8,9。オルガノイドは、切除または生検された正常、罹患、炎症、または癌組織のいずれかから効率的に確立され、不均一な患者特異的応答を表す10、11、12、13、14、15、16。本稿では、オルガノイド培養物由来の腸上皮単層を確立する方法を実証する。単層は、小腸ならびに結腸および直腸オルガノイド培養物から首尾よく確立されている。このモデルは、上皮細胞の薬物への輸送と透過性、ならびに上皮に対するそれらの毒物学的効果を研究する機会を作り出す。さらに、このモデルにより、免疫細胞および細菌との共培養が腸上皮との相互作用を研究することができる17、18、19。さらに、このモデルは、患者固有の方法で治療に対する応答を研究し、上皮バリアに焦点を当てた治療の次の波を探すためのスクリーニング努力を開始するために使用することができる。このようなアプローチは、クリニックに拡張され、パーソナライズされた治療への道を開くことができます。
このプロトコールにおける上皮単層はヒト正常腸管オルガノイドから調製されるが、このプロトコルは他のオルガノイドモデルに適用され、最適化され得る。上皮オルガノイド単層は、幹細胞増殖を支持するためにWntを含有する腸管オルガノイド増殖培地中で培養され、腸管陰窩細胞組成物を表す。腸オルガノイドは、Wnt、Notch、および上皮成長因子(EGF)経路を調節することによって、腸細胞、パネス、ゴブレット、および腸内分泌細胞などの異なる腸上皮脂肪を有するように富化することができる。ここで、膨張培地中で単層が樹立された後、それらは、先に説明したように、より分化した腸上皮細胞に向かって駆動される20、21、22、23、24、25。スクリーニング目的のために、目的の化合物、その標的細胞、および実験条件の作用様式に応じて、単層を選択した細胞組成物に向かって駆動して、関連する機能的読み出しを有する化合物の効果を測定することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコールは、腸管オルガノイドの一般的な操作および維持、ならびにこれらのオルガノイドに由来する上皮単層の調製および可能な適用を記載する。今日まで、単層は、十二指腸、回腸、および正常および以前におよび活発に炎症を起こした腸組織に由来する結腸オルガノイドの異なる領域から首尾よく調製されてきた(未発表データ)。患者由来のオルガノイド単層の適用は、疾患?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は 、Topsector Life Sciences & Health – Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland(LSH-TKI )の官民パートナーシップ(PPP)手当によって支援されており、プロジェクト番号LSHM16021オルガノイドは、Hubrecht Organoid Technology(HUB)への毒物学モデリングのための新しいツールとして、HUBは疾患モデリングおよび毒物学部門に内部資金を供給しています。我々は、Sabine Middendorp(小児胃腸科、Wilhelmina Children’s Hospital、UMC、Utrecht)およびHugo R. de JongeおよびMarcel J.C. Bijvelds(消化器科および肝臓科、エラスムスMC、ロッテルダム)の研究室が、膜挿入物に単層を設置するための初期技術サポートを提供してくれたことに感謝します。
Materials
| 100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| 15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | Plates require REMS AutoSampler for TEER measurements |
| 24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
| 24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | membrane inserts |
| 40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
| 96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
| 96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CO2 incubator | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Glass pipettes | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
| Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
| Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
| Microtome | Leica | ||
| MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
| Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
| Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
| Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
| Plate shaker | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
| Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
| Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
| Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent |
| Water bath | Grant | ||
| Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |
Referências
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