척추동물 축 신장 및 세분화를 연구하기 위한 세 가지 및 네 차원 시각화 및 분석 접근법
Summary
여기에서는 축 신장 및 세분화의 맥락에서 마우스 배아의 세 가지 및 네 차원 이미지 데이터를 시각화하고 분석 할 수있는 계산 도구 및 방법을 설명하고, 토토 광학 투영 단층 촬영에서 얻은 다중 광자 현미경을 사용하여 라이브 이미징 및 전체 마운트 면역 형광 염색을 수행합니다.
Abstract
Somitogenesis는 척추 동물 배아 발달의 특징입니다. 수년 동안 연구자들은 생체외 및 시험관 내 접근법을 포괄하는 광범위한 기술을 사용하여 다양한 유기체에서이 과정을 연구해 왔습니다. 그러나 대부분의 연구는 여전히 2차원(2D) 이미징 데이터의 분석에 의존하고 있으며, 이는 복잡한 3D 공간에서 매우 역동적인 상호작용을 수반하는 축방향 확장 및 소미토제네시스와 같은 발달 과정에 대한 적절한 평가를 제한합니다. 여기서는 마우스 라이브 이미징 획득, 데이터 세트 처리, 시각화 및 분석을 3D 및 4D로 하여 이러한 발달 과정에 관여하는 세포(예: 신경중배엽 선조)를 연구할 수 있는 기술을 설명합니다. 우리는 또한 마우스 배아에서 광학 프로젝션 단층 촬영 및 전체 마운트 면역 형광 현미경 검사 (샘플 준비에서 이미지 수집까지)를위한 단계별 프로토콜을 제공하고 3D 이미지 데이터를 처리하고 시각화하기 위해 개발 한 파이프 라인을 보여줍니다. 우리는 이러한 기술 중 일부의 사용을 확장하고 축 방향 확장 및 소마이트 형성 (예 : 3D 재구성)에 대한 현재의 이해를 향상시키는 데 사용할 수있는 다양한 사용 가능한 소프트웨어 (예 : 피지 / ImageJ, Drishti, Amira 및 Imaris)의 특정 기능을 강조합니다. 전체적으로 여기에 설명 된 기술은 발달 생물학에서 3D 데이터 시각화 및 분석의 중요성을 강조하며 다른 연구자가 척추 동물 축 확장 및 세분화의 맥락에서 3D 및 4D 이미지 데이터를보다 잘 다루는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로,이 연구는 또한 척추 동물 배아 발달을 가르치기 위해 새로운 도구를 사용합니다.
Introduction
척추 동물의 체축 형성은 배아 발달 중에 발생하는 매우 복잡하고 역동적 인 과정입니다. 위축이 끝날 때 [마우스에서, 배아 일 (E) 8.0 전후], 신경 중배엽 선조 (NMPs)로 알려진 에피아세포 전구 세포 그룹이 머리에서 꼬리 서열에서 축 방향 확장의 핵심 동인이되어 목, 몸통 및 꼬리 형성 중에 신경관과 동축 중배엽 조직을 생성합니다 1,2,3,4 . 흥미롭게도, 이러한 NMP가 인과성 표피세포에서 차지하는 위치는 중배엽 또는 신경외배엽(neuroectoderm5)으로 분화하는 결정에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 우리는 현재 NMP에 대한 정확한 분자 지문이 부족하지만, 이들 세포는 일반적으로 T (Brachyury)와 Sox2 5,6을 공동 발현하는 것으로 생각된다. NMP 운명 결정을 조절하는 정확한 메커니즘 (즉, 신경 또는 중배엽 경로를 취하는지 여부)은 정확하게 정의되기 시작했습니다. 원시적 줄무늬 영역에서의 Tbx6 발현은 NMP 운명 결정의 초기 마커이며, 이 유전자는 중배엽 6,7의 유도 및 사양에 관여하기 때문이다. 흥미롭게도, 초기 중배엽 세포는 높은 수준의 Epha18을 발현하는 것으로 보이며, Wnt/β-catenin 신호전달뿐만 아니라 Msgn1도 역축성 중배엽 분화 및 소마이트 형성 9,10에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 단일 세포 수준에서 NMP에 대한 완전한 공간적 시간 분석은 중배엽 사양을 제어하는 분자 메커니즘을 완전히 이해하는 데 확실히 도움이 될 것입니다.
somites (척추 전구체)의 형성은 척추 동물의 주요 특징입니다. 축 신장 동안, 역축 중배엽은 somites로 알려진 일련의 양측 반복 단위로 분할된다. somite의 수와 새로운 세그먼트의 형성에 필요한 시간은 종11,12에 따라 다릅니다. 소미토제네시스는 전소미성 중배엽(예를 들어, Lfng)11,12에서 Notch, Wnt 및 Fgf 신호전달 경로의 몇몇 유전자의 순환 발현에 의해 관찰될 수 있는 주기적 신호전달 진동(“세그멘테이션 클록”으로 알려짐)을 수반한다. somitogenesis의 현재 모델은 또한 각각의 새로운 소마이트의 후부 경계의 위치를 정의하는 Fgf, Wnt 및 레티노산 신호 전달을 포함하는 일련의 복잡한 신호 구배인 “성숙 파면”의 존재를 가정한다. 따라서 “세분화 시계”와 “성숙 파면” 사이의 조율된 상호작용은 이러한 주요 형태형성 과정의 교란이 배아 치사율 또는 선천성 기형(예를 들어, 척추측만증)의 형성을 초래할 수 있기 때문에 이러한 척추 전구체 모듈의 생성에 필수적이다(예를 들어, 척추측만증)13,14,15.
이미징 기술, 생체 영상 분석 방법 및 소프트웨어의 상당한 최근 발전에도 불구하고, 축 신장 및 소미토제네시스에 대한 대부분의 연구는 여전히 단일 / 분리 된 이차원 이미지 데이터 (예 : 섹션)에 의존하고 있으며, 이는 완전한 다차원 조직 시각화를 허용하지 않으며 병리학 적 기형 (즉, 돌연변이로 인한) 대 배아 발달 중에 발생하는 정상적인 형태 학적 변화 사이의 명확한 분화를 복잡하게 만듭니다16 . 3D에서의 이미징은 이전에 표준 2D 방법17,18,19,20에 의해 확인되지 않은 새로운 형태 유전 학적 움직임을 이미 밝혀 냈으며, 척추 동물 소미토제네시스 및 축 방향 확장의 메커니즘을 이해하기 위해 토토 이미징의 힘을 강조합니다.
마우스 배아의 3D 및 4D 현미경 검사, 특히 라이브 이미징은 기술적으로 어려운 일이며 정확하고 의미있는 시공간 분석을 위해 샘플 준비, 이미지 수집 및 데이터 전처리 중에 중요한 단계가 필요합니다. 여기에서, 우리는 축 확장 및 분절 동안 NMP 및 중배엽 세포 모두를 연구하는데 사용될 수 있는 마우스 배아의 살아있는 이미징 및 전체 마운트 면역형광 염색을 위한 상세한 프로토콜을 기술한다. 또한, 우리는 또한 오래된 배아 및 태아의 광학 투영 단층 촬영 (OPT)을위한 프로토콜을 설명하는데, 이는 소밀 토제이 (예를 들어, 뼈 융합 및 척추 측만증) 동안 문제로 인해 발생할 수있는 병리학 적 이상을 시각화하고 정량화하는 토토에서 3D를 허용합니다 13,21,22. 마지막으로, 우리는 척추 동물 세분화 및 축 신장에 대한 연구와 교육에서 3D 이미징 재구성의 힘을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
축 신장과 세분화는 척추 동물 배아 발달 중에 발생하는 가장 복잡하고 역동적 인 과정 중 두 가지입니다. 단일 세포 추적과 함께 3D 및 4D 이미징의 사용은 한동안 제브라 피쉬와 닭 배아 모두에서 이러한 과정을 연구하기 위해 적용되었으며, 접근성과 배양 조건은 복잡한 이미징을 용이하게합니다 19,44,45,46,47,48,49 <sup c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LuVeLu 기자 균주에 대한 Olivier Pourquié와 Alexander Aulehla, RapiClear 테스트 샘플의 SunJin 실험실, BigStitcher를 사용하여 도움을 주신 Hugo Pereira, 라이브 이미징 장치, IGC 동물 시설 및 Mallo 실험실의 과거와 현재 구성원에게 유용한 의견과 지원을 해주신 것에 대해 감사드립니다.
포르투갈 기금 ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 및 ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017이 지원하는 IGC의 고급 이미징 시설의 기술 지원에 감사 드리며, 포르투갈 2020 파트너십 계약에 따라 유럽 지역 개발 기금 (FEDER) 및 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, 포르투갈)를 통해 Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020)이 공동 자금을 지원합니다. 이 원고에 설명 된 작업은 LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, 포르투갈) 및 SCML-MC-60-2014 (포르투갈 산타 카사 다 미세 리코 디아)를 M.M., 연구 인프라 Congento, 프로젝트 LISBOA-01-0145-FEDER-022170 및 박사 학위 펠로우십 PD / BD / 128426 / 2017을 A.D.에 부여함으로써 지원되었습니다.
Materials
| Agarose low gelling temperature | Sigma | A9414 | Used to mounting embryos (e.g. for OPT) |
| Amira software | Thermofisher | – | Commerial software tool |
| Anti-Brachyury (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF2085 RRID:AB_2200235 | For immunofluorescence |
| Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab92494 RRID:AB_10585428 | For immunofluorescence |
| Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF4744 RRID:AB_2200834 | For immunofluorescence |
| Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) | Sigma | L9393 RRID:AB_477163 | For immunofluorescence |
| Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) | Molecular Probes | A11055 RRID:AB_2534102 | For immunofluorescence |
| Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) | ThermoFisher Scientific | A10042 RRID:AB_2534017 | For immunofluorescence |
| Benzyl Alcohol (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Benzyl Benzoate (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Bovine serum albumin | Biowest | P6154 | For immunofluorescence |
| Coverglass 20×20 mm #0 | (any) | – | 100um thick |
| Coverglass 20×20 mm #1 | (any) | – | 170um thick |
| Coverglass 20×60 mm #1.5 | (any) | – | To use as “slides” |
| DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) | Life Technologies | D3571 | For immunofluorescence |
| Drishti software | (open source) | – | Free software tool |
| EDTA | Sigma | ED2SS | For demineralization |
| Fiji/ImageJ software | (open source) | – | Free software tool |
| Glycine | NZYtech | MB01401 | For immunofluorescence |
| Huygens software | Scientific Volume Imaging | – | Commerial software tool |
| HyClone defined fetal bovine serum | GE Healthcare | #HYCLSH30070.03 | For live imaging |
| Hydrogen peroxide solution 30 % | Milipore | 1085971000 | For clearing |
| Imaris software | Bitplane / Oxford instruments | – | Commerial software tool |
| iSpacers | SunJin Lab | (varies) | Use as spacers for preparations |
| L-glutamine | Gibco | #25030–024 | For live imaging medium |
| Low glucose DMEM | Gibco | 11054020 | For live imaging medium |
| M2 medium | Sigma | M7167 | To dissect embryos |
| Methanol | VWR | VWRC20847.307 | For dehydration and rehydration steps |
| Methyl salicylate | Sigma | M6752 | Used to clear embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Used in solution to fix embryos |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | #P0781 | For live imaging medium |
| PBS (Phosphate-buffered saline solution) | Biowest | L0615-500 | – |
| RapiClear | SunJin Laboratory | RapiClear 1.52 | Used to clear embryos |
| Secure-Sea hybridization chambers | Sigma | C5474 | Use as spacers for preparations |
| simLab software | SimLab soft | – | Commerial software tool |
| Slide, depression concave glass – 75×25 mm | (any) | – | To mount thick embryos. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | For immunofluorescence |
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