Approches de visualisation et d’analyse tridimensionnelles et quadridimensionnelles pour étudier l’allongement et la segmentation axial des vertébrés
Summary
Nous décrivons ici des outils et des méthodes de calcul qui permettent la visualisation et l’analyse de données d’images tridimensionnelles et quadridimensionnelles d’embryons de souris dans le contexte de l’allongement axial et de la segmentation, obtenues par tomographie par projection optique in toto, et par imagerie en direct et coloration par immunofluorescence en monture entière à l’aide de la microscopie multiphotonique.
Abstract
La somitogenèse est une caractéristique du développement embryonnaire des vertébrés. Pendant des années, les chercheurs ont étudié ce processus dans une variété d’organismes en utilisant un large éventail de techniques englobant des approches ex vivo et in vitro. Cependant, la plupart des études reposent encore sur l’analyse de données d’imagerie bidimensionnelle (2D), ce qui limite l’évaluation correcte d’un processus de développement comme l’extension axiale et la somitogenèse impliquant des interactions hautement dynamiques dans un espace 3D complexe. Nous décrivons ici les techniques qui permettent l’acquisition d’images en direct de souris, le traitement d’ensembles de données, la visualisation et l’analyse en 3D et 4D pour étudier les cellules (par exemple, les progéniteurs neuromésodermiques) impliquées dans ces processus de développement. Nous fournissons également un protocole étape par étape pour la tomographie par projection optique et la microscopie par immunofluorescence à montage entier dans des embryons de souris (de la préparation de l’échantillon à l’acquisition d’images) et montrons un pipeline que nous avons développé pour traiter et visualiser les données d’images 3D. Nous étendons l’utilisation de certaines de ces techniques et mettons en évidence les caractéristiques spécifiques de différents logiciels disponibles (par exemple, Fidji / ImageJ, Drishti, Amira et Imaris) qui peuvent être utilisés pour améliorer notre compréhension actuelle de l’extension axiale et de la formation de somite (par exemple, les reconstructions 3D). Dans l’ensemble, les techniques décrites ici soulignent l’importance de la visualisation et de l’analyse de données 3D en biologie du développement et pourraient aider d’autres chercheurs à mieux traiter les données d’images 3D et 4D dans le contexte de l’extension et de la segmentation axiales des vertébrés. Enfin, le travail utilise également de nouveaux outils pour faciliter l’enseignement du développement embryonnaire des vertébrés.
Introduction
La formation de l’axe du corps des vertébrés est un processus très complexe et dynamique qui se produit au cours du développement embryonnaire. À la fin de la gastrulation [chez la souris, vers le jour embryonnaire (E) 8.0], un groupe de cellules progénitrices épiblastiques connues sous le nom de progéniteurs neuromésodermiques (NMP) deviennent un facteur clé de l’extension axiale dans une séquence tête-queue, générant le tube neural et les tissus mésodermiques paraxiaux lors de la formation du cou, du tronc et de la queue 1,2,3,4 . Fait intéressant, la position que ces NMP occupent dans l’épiblaste caudal semble jouer un rôle clé dans la décision de différenciation en mésoderme ou neuroectoderme5. Bien que nous manquions actuellement d’une empreinte moléculaire précise pour les NMP, on pense généralement que ces cellules co-expriment T (Brachyury) et Sox2 5,6. Les mécanismes exacts régulant les décisions relatives au devenir des NMP (c.-à-d. s’ils prennent des voies neuronales ou mésodermiques) commencent seulement à être définis avec précision. L’expression de Tbx6 dans la région primitive de la striure est un marqueur précoce de la décision du devenir NMP, car ce gène est impliqué dans l’induction et la spécification du mésoderme 6,7. Fait intéressant, les premières cellules du mésoderme semblent exprimer des niveaux élevés d’Epha18, et la signalisation Wnt / β-caténine, ainsi que Msgn1 ont également joué un rôle important dans la différenciation du mésoderme paraxial et la formation de somite 9,10. Une analyse spatio-temporelle complète des PNM au niveau d’une seule cellule sera certainement déterminante pour bien comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la spécification du mésoderme.
La formation de somites (précurseurs des vertèbres) est une caractéristique clé des vertébrés. Au cours de l’allongement axial, le mésoderme paraxial devient segmenté en une série d’unités répétitives bilatérales appelées somites. Le nombre de somites et le temps nécessaire à la formation de nouveaux segments varient selon les espèces 11,12. La somitogenèse implique des oscillations de signalisation périodiques (connues sous le nom d’« horloge de segmentation ») qui peuvent être observées par l’expression cyclique de plusieurs gènes des voies de signalisation Notch, Wnt et Fgf dans le mésoderme présomitique (par exemple, Lfng)11,12. Le modèle actuel de somitogenèse postule également l’existence d’un « front d’onde de maturation », une série de gradients de signalisation complexes impliquant Fgf, Wnt et la signalisation de l’acide rétinoïque qui définissent la position de la bordure postérieure de chaque nouvelle somite. Une interaction coordonnée entre « l’horloge de segmentation » et le « front d’onde de maturation » est donc fondamentale pour la génération de ces modules précurseurs de vertèbres, car des perturbations dans ces processus morphogénétiques clés peuvent entraîner une létalité embryonnaire ou la formation de malformations congénitales (par exemple, la scoliose)13,14,15.
Malgré les progrès récents substantiels dans les techniques d’imagerie, les méthodes d’analyse de bioimage et les logiciels, la plupart des études sur l’allongement axial et la somitogenèse reposent toujours sur des données d’image bidimensionnelles uniques / isolées (par exemple, des sections), ce qui ne permet pas une visualisation complète des tissus multidimensionnels et complique la différenciation claire entre les malformations pathologiques (c’est-à-dire dues à des mutations) et les variations morphologiques normales survenant au cours du développement embryonnaire16 . L’imagerie en 3D a déjà mis au jour de nouveaux mouvements morphogénétiques, qui n’étaient pas identifiés auparavant par les méthodes 2D standard 17,18,19,20, mettant en évidence la puissance de l’imagerie in toto pour comprendre les mécanismes de la somitogenèse des vertébrés et de l’extension axiale.
La microscopie 3D et 4D d’embryons de souris, en particulier l’imagerie en direct, est techniquement difficile et nécessite des étapes critiques lors de la préparation des échantillons, de l’acquisition d’images et du prétraitement des données afin de permettre une analyse spatio-temporelle précise et significative. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour l’imagerie en direct et la coloration par immunofluorescence en monture entière d’embryons de souris, qui peut être utilisé pour étudier à la fois les NMP et les cellules mésodermiques pendant l’extension axiale et la segmentation. En outre, nous décrivons également un protocole de tomographie par projection optique (OPT) d’embryons et de fœtus plus âgés, qui permet la visualisation et la quantification en 3D des anomalies pathologiques pouvant résulter de problèmes lors de la somitogenèse (par exemple, fusion osseuse et scoliose)13,21,22. Enfin, nous illustrons la puissance des reconstructions d’imagerie 3D dans l’étude et l’enseignement de la segmentation des vertébrés et de l’allongement axial.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’allongement axial et la segmentation sont deux des processus les plus complexes et les plus dynamiques qui se produisent au cours du développement embryonnaire des vertébrés. L’utilisation de l’imagerie 3D et 4D avec suivi unicellulaire est appliquée, depuis un certain temps, pour étudier ces processus chez les embryons de poisson-zèbre et de poulet, pour lesquels l’accessibilité et les conditions de culture facilitent l’imagerie complexe 19,44,45,46,47,48,49 <sup cla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Olivier Pourquié et Alexander Aulehla pour la souche reporter LuVeLu, le laboratoire SunJin pour l’échantillon d’essai RapiClear, Hugo Pereira pour l’aide apportée à BigStitcher, Nuno Granjeiro pour avoir aidé à mettre en place l’appareil d’imagerie en direct, l’installation animale IGC et les membres passés et présents du laboratoire Mallo pour les commentaires utiles et le soutien au cours de ce travail.
Nous remercions le soutien technique de l’installation d’imagerie avancée de l’IGC, qui est soutenu par un financement portugais ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 et ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, cofinancé par le programme opérationnel régional de Lisbonne (Lisboa 2020), dans le cadre de l’accord de partenariat Portugal 2020, par l’intermédiaire du Fonds européen de développement régional (FEDER) et de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). Les travaux décrits dans ce manuscrit ont été soutenus par des subventions LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) et SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) à M.M., l’infrastructure de recherche Congento, le projet LISBOA-01-0145-FEDER-022170, et la bourse de doctorat PD/BD/128426/2017 à A.D.
Materials
| Agarose low gelling temperature | Sigma | A9414 | Used to mounting embryos (e.g. for OPT) |
| Amira software | Thermofisher | – | Commerial software tool |
| Anti-Brachyury (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF2085 RRID:AB_2200235 | For immunofluorescence |
| Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab92494 RRID:AB_10585428 | For immunofluorescence |
| Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF4744 RRID:AB_2200834 | For immunofluorescence |
| Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) | Sigma | L9393 RRID:AB_477163 | For immunofluorescence |
| Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) | Molecular Probes | A11055 RRID:AB_2534102 | For immunofluorescence |
| Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) | ThermoFisher Scientific | A10042 RRID:AB_2534017 | For immunofluorescence |
| Benzyl Alcohol (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Benzyl Benzoate (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Bovine serum albumin | Biowest | P6154 | For immunofluorescence |
| Coverglass 20×20 mm #0 | (any) | – | 100um thick |
| Coverglass 20×20 mm #1 | (any) | – | 170um thick |
| Coverglass 20×60 mm #1.5 | (any) | – | To use as “slides” |
| DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) | Life Technologies | D3571 | For immunofluorescence |
| Drishti software | (open source) | – | Free software tool |
| EDTA | Sigma | ED2SS | For demineralization |
| Fiji/ImageJ software | (open source) | – | Free software tool |
| Glycine | NZYtech | MB01401 | For immunofluorescence |
| Huygens software | Scientific Volume Imaging | – | Commerial software tool |
| HyClone defined fetal bovine serum | GE Healthcare | #HYCLSH30070.03 | For live imaging |
| Hydrogen peroxide solution 30 % | Milipore | 1085971000 | For clearing |
| Imaris software | Bitplane / Oxford instruments | – | Commerial software tool |
| iSpacers | SunJin Lab | (varies) | Use as spacers for preparations |
| L-glutamine | Gibco | #25030–024 | For live imaging medium |
| Low glucose DMEM | Gibco | 11054020 | For live imaging medium |
| M2 medium | Sigma | M7167 | To dissect embryos |
| Methanol | VWR | VWRC20847.307 | For dehydration and rehydration steps |
| Methyl salicylate | Sigma | M6752 | Used to clear embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Used in solution to fix embryos |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | #P0781 | For live imaging medium |
| PBS (Phosphate-buffered saline solution) | Biowest | L0615-500 | – |
| RapiClear | SunJin Laboratory | RapiClear 1.52 | Used to clear embryos |
| Secure-Sea hybridization chambers | Sigma | C5474 | Use as spacers for preparations |
| simLab software | SimLab soft | – | Commerial software tool |
| Slide, depression concave glass – 75×25 mm | (any) | – | To mount thick embryos. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | For immunofluorescence |
Referências
- Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
- Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
- Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
- Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
- Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
- Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
- de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
- Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
- Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
- Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
- Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
- Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
- Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
- Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Biologia do Desenvolvimento. 371 (2), 235-245 (2012).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
- McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
- Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
- Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
- Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
- Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
- Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
- Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
- Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
- Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
- Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
- Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
- Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
- Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
- Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
- Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
- Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
- Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
- . Thermofisher.com Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020)
- . Simlab-soft.com Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020)
- Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
- Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
- Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
- Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
- Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
- Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Jost, A. P. -. T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
- Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
- Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
- Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
- Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
- Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
- Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).
