Tre- och fyrdimensionell visualiserings- och analysmetoder för att studera ryggradsdjurs axiella förlängning och segmentering
Summary
Här beskriver vi beräkningsverktyg och metoder som möjliggör visualisering och analys av tre- och fyrdimensionella bilddata för musembryon i samband med axiell förlängning och segmentering, erhållen genom in toto optisk projektionstomografi och genom levande avbildning och helmonterad immunofluorescensfärgning med hjälp av multifotonmikroskopi.
Abstract
Somitogenes är ett kännetecken för ryggradsdjurens embryonala utveckling. I åratal har forskare studerat denna process i en mängd olika organismer med hjälp av ett brett spektrum av tekniker som omfattar ex vivo- och in vitro-metoder. De flesta studier är emellertid fortfarande beroende av analys av tvådimensionella (2D) bilddata, vilket begränsar korrekt utvärdering av en utvecklingsprocess som axiell förlängning och somitogenes som involverar mycket dynamiska interaktioner i ett komplext 3D-utrymme. Här beskriver vi tekniker som gör det möjligt för mus live imaging acquisition, dataset bearbetning, visualisering och analys i 3D och 4D att studera cellerna (t.ex. neuromesodermala förfäder) som är involverade i dessa utvecklingsprocesser. Vi tillhandahåller också ett steg-för-steg-protokoll för optisk projektionstomografi och fullmonterad immunofluorescensmikroskopi i musembryon (från provberedning till bildförvärv) och visar en pipeline som vi utvecklat för att bearbeta och visualisera 3D-bilddata. Vi utökar användningen av några av dessa tekniker och belyser specifika egenskaper hos olika tillgängliga program (t.ex. Fiji / ImageJ, Drishti, Amira och Imaris) som kan användas för att förbättra vår nuvarande förståelse av axiell förlängning och somitbildning (t.ex. 3D-rekonstruktioner). Sammantaget betonar de tekniker som beskrivs här vikten av 3D-datavisualisering och analys i utvecklingsbiologi och kan hjälpa andra forskare att bättre ta itu med 3D- och 4D-bilddata i samband med ryggradsdjurs axiella förlängning och segmentering. Slutligen använder arbetet också nya verktyg för att underlätta undervisning i embryonal utveckling av ryggradsdjur.
Introduction
Ryggradsdjurens kroppsaxelbildning är en mycket komplex och dynamisk process som sker under embryonal utveckling. I slutet av gastrulationen [i musen, runt embryonal dag (E) 8.0] blir en grupp epiblaststamceller som kallas neuromesodermala förfäder (NMP) en viktig drivkraft för axiell förlängning i en huvud-till-svans-sekvens, vilket genererar neuralröret och paraxial mesodermala vävnader under nacke, bål och svansbildning 1,2,3,4 . Intressant nog verkar den position som dessa NMP upptar i den kaudala epiblasten spela en nyckelroll i beslutet att differentiera till mesoderm eller neuroektoderm5. Även om vi för närvarande saknar ett exakt molekylärt fingeravtryck för NMP, anses dessa celler i allmänhet samuttrycka T (Brachyury) och Sox2 5,6. De exakta mekanismerna som reglerar NMP-ödesbeslut (dvs. om de tar neurala eller mesodermala vägar) börjar bara definieras exakt. Tbx6-uttryck i den primitiva streckregionen är en tidig markör för NMP-ödesbeslut, eftersom denna gen är involverad i induktionen och specifikationen av mesoderm 6,7. Intressant nog verkar tidiga mesodermceller uttrycka höga nivåer av Epha18, och Wnt / β-kateninsignalering, liksom Msgn1 visade sig också spela viktiga roller i paraxial mesodermdifferentiering och somitbildning 9,10. En fullständig rumslig-temporal analys av NMP på encellsnivå kommer säkert att vara avgörande för att fullt ut förstå de molekylära mekanismerna som styr mesodermspecifikationen.
Bildandet av somiter (ryggkotor) är en viktig egenskap hos ryggradsdjur. Under axiell förlängning segmenteras den paraxiella mesodermen i en serie bilaterala upprepande enheter som kallas somiter. Antalet somiter och den tid som krävs för bildandet av nya segment varierar mellan arter11,12. Somitogenes involverar periodiska signaloscillationer (känd som “segmenteringsklockan”) som kan observeras genom det cykliska uttrycket av flera gener i Notch-, Wnt- och Fgf-signalvägarna i den presomitiska mesodermen (t.ex. Lfng)11,12. Den nuvarande modellen för somitogenes postulerar också förekomsten av en “mognadsvågfront”, en serie komplexa signalgradienter som involverar Fgf, Wnt och retinsyrasignalering som definierar positionen för den bakre gränsen för varje ny somit. En samordnad interaktion mellan “segmenteringsklockan” och “mognadsvågfronten” är därför grundläggande för genereringen av dessa vertebrae-prekursormoduler, eftersom störningar i dessa viktiga morfogenetiska processer kan leda till embryonal dödlighet eller till bildandet av medfödda missbildningar (t.ex. skolios)13,14,15.
Trots betydande framsteg på senare tid inom bildteknik, biobildanalysmetoder och programvara förlitar sig de flesta studier av axiell töjning och somitogenes fortfarande på enstaka / isolerade tvådimensionella bilddata (t.ex. sektioner), vilket inte tillåter en fullständig flerdimensionell vävnadsvisualisering och komplicerar tydlig differentiering mellan patologiska missbildningar (dvs. på grund av mutationer) jämfört med normal morfologisk variation som inträffar under embryonal utveckling16 . Avbildning i 3D har redan avslöjat nya morfogenetiska rörelser, som tidigare inte identifierats med standard 2D-metoder 17,18,19,20, vilket belyser kraften i in toto-avbildning för att förstå mekanismerna för ryggradsdjur somitogenes och axiell förlängning.
3D- och 4D-mikroskopi av musembryon, särskilt levande avbildning, är tekniskt utmanande och kräver kritiska steg under provberedning, bildinsamling och förbehandling av data för att möjliggöra korrekt och meningsfull spatio-temporal analys. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för levande avbildning och helmonterad immunofluorescensfärgning av musembryon, som kan användas för att studera både NMP och mesodermala celler under axiell förlängning och segmentering. Dessutom beskriver vi också ett protokoll för optisk projektionstomografi (OPT) av äldre embryon och foster, som möjliggör 3D i totovisualisering och kvantifiering av patologiska abnormiteter som kan uppstå från problem under somitogenes (t.ex. benfusion och skolios)13,21,22. Slutligen illustrerar vi kraften i 3D-bildrekonstruktioner i studien och undervisningen av ryggradsdjurs segmentering och axiell förlängning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Axiell förlängning och segmentering är två av de mest komplexa och dynamiska processerna som förekommer under embryonal utveckling av ryggradsdjur. Användningen av 3D- och 4D-avbildning med encellsspårning har under en tid tillämpats för att studera dessa processer i både zebrafisk- och kycklingembryon, för vilka tillgänglighet och odlingsförhållanden underlättar komplex avbildning 19,44,45,46,47,48,49<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Olivier Pourquié och Alexander Aulehla för LuVeLu-reporterstammen, SunJin-laboratoriet för RapiClear-testprovet, Hugo Pereira för hjälpen med att använda BigStitcher, Nuno Granjeiro för att ha hjälpt till att sätta upp levande bildapparat, IGC-djuranläggningen och tidigare och nuvarande medlemmar i Mallo-laboratoriet för användbara kommentarer och stöd under detta arbete.
Vi tackar det tekniska stödet från regeringskonferensens Advanced Imaging Facility, som stöds av portugisisk finansiering ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 och ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, medfinansierad av Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020), inom ramen för Portugals partnerskapsavtal 2020, genom Europeiska regionala utvecklingsfonden (Feder) och Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). Arbetet som beskrivs i detta manuskript stöddes av bidrag LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) och SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) till M.M., forskningsinfrastrukturen Congento, projekt LISBOA-01-0145-FEDER-022170 och doktorandstipendiet PD/BD/128426/2017 till A.D.
Materials
| Agarose low gelling temperature | Sigma | A9414 | Used to mounting embryos (e.g. for OPT) |
| Amira software | Thermofisher | – | Commerial software tool |
| Anti-Brachyury (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF2085 RRID:AB_2200235 | For immunofluorescence |
| Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab92494 RRID:AB_10585428 | For immunofluorescence |
| Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF4744 RRID:AB_2200834 | For immunofluorescence |
| Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) | Sigma | L9393 RRID:AB_477163 | For immunofluorescence |
| Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) | Molecular Probes | A11055 RRID:AB_2534102 | For immunofluorescence |
| Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) | ThermoFisher Scientific | A10042 RRID:AB_2534017 | For immunofluorescence |
| Benzyl Alcohol (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Benzyl Benzoate (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Bovine serum albumin | Biowest | P6154 | For immunofluorescence |
| Coverglass 20×20 mm #0 | (any) | – | 100um thick |
| Coverglass 20×20 mm #1 | (any) | – | 170um thick |
| Coverglass 20×60 mm #1.5 | (any) | – | To use as “slides” |
| DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) | Life Technologies | D3571 | For immunofluorescence |
| Drishti software | (open source) | – | Free software tool |
| EDTA | Sigma | ED2SS | For demineralization |
| Fiji/ImageJ software | (open source) | – | Free software tool |
| Glycine | NZYtech | MB01401 | For immunofluorescence |
| Huygens software | Scientific Volume Imaging | – | Commerial software tool |
| HyClone defined fetal bovine serum | GE Healthcare | #HYCLSH30070.03 | For live imaging |
| Hydrogen peroxide solution 30 % | Milipore | 1085971000 | For clearing |
| Imaris software | Bitplane / Oxford instruments | – | Commerial software tool |
| iSpacers | SunJin Lab | (varies) | Use as spacers for preparations |
| L-glutamine | Gibco | #25030–024 | For live imaging medium |
| Low glucose DMEM | Gibco | 11054020 | For live imaging medium |
| M2 medium | Sigma | M7167 | To dissect embryos |
| Methanol | VWR | VWRC20847.307 | For dehydration and rehydration steps |
| Methyl salicylate | Sigma | M6752 | Used to clear embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Used in solution to fix embryos |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | #P0781 | For live imaging medium |
| PBS (Phosphate-buffered saline solution) | Biowest | L0615-500 | – |
| RapiClear | SunJin Laboratory | RapiClear 1.52 | Used to clear embryos |
| Secure-Sea hybridization chambers | Sigma | C5474 | Use as spacers for preparations |
| simLab software | SimLab soft | – | Commerial software tool |
| Slide, depression concave glass – 75×25 mm | (any) | – | To mount thick embryos. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | For immunofluorescence |
Referências
- Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
- Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
- Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
- Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
- Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
- Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
- de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
- Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
- Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
- Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
- Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
- Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
- Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
- Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Biologia do Desenvolvimento. 371 (2), 235-245 (2012).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
- McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
- Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
- Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
- Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
- Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
- Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
- Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
- Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
- Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
- Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
- Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
- Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
- Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
- Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
- Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
- Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
- Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
- . Thermofisher.com Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020)
- . Simlab-soft.com Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020)
- Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
- Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
- Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
- Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
- Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
- Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Jost, A. P. -. T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
- Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
- Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
- Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
- Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
- Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
- Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).
