Vi presenterar detaljer om laboratorieförfaranden för läkemedelsfri in vitro aktivering (IVA) av äggstockssäckar för patienter med allvarliga äggstockscancer dysfunktion. Denna metod kan öka antalet återvinningsbara äggceller per äggstockscancer hyperstimulering och gynna fertilitet bevarande för dessa patienter.
Äggstocksfunktionen minskar gradvis under åldrande och i vissa patofysiologiska tillstånd inklusive karyotyp onormala tillstånd, autoimmuna sjukdomar, cellgifts- och strålningsbehandlingar, samt äggstocksoperationer. Hos ogifta kvinnor med svår äggstocksdysfunktion är fertilitetsbevarande viktigt för framtida graviditeter. Även om oocyte cryopreservation är en etablerad metod för fertilitet bevarande, dessa patienter kunde endast bevara ett begränsat antal äggceller även efter äggstockscancer överstimulering, vilket leder till upprepade stimuleringar för att säkerställa tillräckliga äggceller för att garantera framtida graviditet. För att lösa detta problem har vi nyligen utvecklat ett läkemedelsfritt in vitro-aktiveringsförfarande (IVA), som gör det möjligt för oss att stimulera tidiga stadier av äggstockssäckar att utvecklas till preantral follikelstadiet. Dessa preantrala folliklar kan svara på det unika protokollet av gonadotropin stimulering, vilket resulterar i ökat antal hämtade äggceller per äggstockscancer stimulering för cryopreservation. Den läkemedelsfria IVA består av kirurgiska tillvägagångssätt och äggstocksstimulering. Vi tog bort en del av cortex från en eller båda äggstockarna från patienter under laparoscopic kirurgi. Äggstockscancer när vävnader skars i små kuber för att störa Hippo signalering utbildningsavsnitt och stimulera utvecklingen av tidiga skede folliklar. Dessa kuber ympades orthotropically i återstående äggstockar samt under serosa av båda äggledare. Vi har redan publicerat det kirurgiska ingreppet i den läkemedelsfria IVA och protokollet om efterföljande äggstocksstimulering, men häri presenterar vi detaljerna i laboratoriemetoder som krävs för läkemedelsfri IVA.
Äggstocksfunktionen minskar gradvis under åldrande och vissa patofysiologiska tillstånd inklusive karyotyp onormala tillstånd, autoimmuna sjukdomar, cellgifts- och strålning-terapier och äggstocksoperationer. Fertilitet bevarande är ett av de bästa alternativen för ogifta kvinnor med svår äggstockscancer dysfunktion för att bevara sin potential för framtida graviditet. För fertilitetsbevarande är för närvarande två metoder tillgängliga mestadels i onko-fertilitetsfältet. Oocyte cryopreservation är ett väletablerat förfarande för fertilitet bevarande och många framgångsrika fall harrapporterats 1,2. Å andra sidan inrättades äggstocksvävnads cryopreservation också för fertilitetsbevarande hos cancerpatienter men det är fortfarande en experimentell strategi3,4. I båda metoderna behövs flera antal mogna äggceller för att graviditet ska inträffa. I allmänhet visade patienter med för tidig äggstocksbrist (POI), som blir amenorré före 40 års ålder, och medelålders kvinnor med låg äggstocksreserv dålig äggstockssvar (POR) på äggstocksstimulering för att ge mogna äggceller5,6,7. Dessutom visade unga patienter med ett lågt antal antral folliklar också POR till äggstocksstimulering7. Dessa patienter har mycket begränsat antal återvinningsbara äggceller även efter korrekt äggstockscancer hyperstimulering, vilket kräver flera dyra förfaranden för att säkerställa ett tillräckligt antal äggceller för graviditet.
Oocyt donation följt av in vitro befruktning (IVF) med makens spermier och embryo överföring (ET) är det enda alternativet för dessa POI och POR patienter som har svårt att få sina egna äggceller8,9,10. Oocyte donation kompliceras dock av etiska frågor samt autoimmuna och graviditet komplikationer11,12,13,14. För att lösa dessa problem önskas etablering av infertilitetsbehandling med patienternas egna äggceller. För POI-patienter har vi utvecklat in vitro aktivering (IVA) strategi för att möjliggöra framgångsrik follikel tillväxt och generering av mogna äggceller, leder ett antal graviditeter och leveranser15. I IVA fragmenterade vi äggstocksbarkar efter avlägsnande av äggstockar under laparoskopisk kirurgi och odlade dem i två dagar för att aktivera folliklar av Akt-stimulerande läkemedel och sedan utföra heterotopisk ympning tillbaka till konstgjorda påsar gjorda under serosa av äggledare under andra laparoskopisk kirurgi15. Detta förfarande främjade tillväxt av ursprungliga, primära och sekundära folliklar efter äggstockscancer cortex fragmentering för att främja Hippo signalering störningar16, följt av två dagar kultur med Akt signalering stimulatorer17.
Till skillnad från allvarliga POI fall, POR patienter med minskad äggstockscancer reserv har flera sekundära folliklar. Eftersom Hippo signalering störningar ensam är effektivt för att främja sekundär follikeltillväxt 16, visade vi nyligen framgångsrika graviditeter och leveranser för POR patienter med hjälp av den läkemedelsfria IVA förfarande som omfattar när fragmentering och ortopic ympning utan behandling av Akt stimulerande läkemedel. Läkemedelsfri IVA stimulerar tidigt stadium av äggstockssäckar att utvecklas till preantral follikelstadiet efter endast en operation och ökade antalet hämtade äggceller för IVF-embryoöverföring15,18. Den läkemedelsfria IVA-metoden har flera fördelar jämfört med vår ursprungliga IVA med 1) undvika potentiella follikel förlust under kultur, 2) minimera invasivitet och kostnader för den andra kirurgi, 3) omfattar endast kortsiktiga post-surgery säng vila och 4) potential av spontana graviditet på grund av att ortopic ympning. Vi publicerade nyligen en videoartikel som visar kirurgiska ingrepp av läkemedelsfri IVA19 och detaljerade protokoll av äggstocksstimulering efter operationen20. Här presenterar vi detaljer om laboratoriemetoder som krävs för läkemedelsfri IVA.
I detta manuskript visade vi ett detaljerat laboratorieprotokoll för drogfri IVA. Den läkemedelsfria IVA är ett nytt tillvägagångssätt för infertilitetsbehandling för POR- patient med minskande äggstocksreserv för att främja sekundär folliklar tillväxt, vilket resulterar i att ge mer mogna äggstockscancer stimulering och öka i framgångsrikgraviditet 20. Hos 15 POR patienter med minskande äggstockscancer reserv, uppnådde detta tillvägagångssätt en spontan graviditet, in vitro b…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Tatsuji Ihana, Sachiyo Kurimoto, Kazuko Takahasih, Yuki Yoshizawa, Maho Arashi, Kentaro Fujita, Erina Kudo, Yuka Kurimoto och Mayuko Wakatsuki för att de stöder det drogfria IVA-förfarandet och prof. Aaron J.W. Hsueh (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA) för kritisk läsning och redigering av manuskriptet. Vi tackar också Rebecca Truman och Gregory Truman för att de infogade engelsk berättelse. Denna studie stöddes av The Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), Scientific Research B (19H03801) och Challenging Exploratory Research (18K19624).
4.5 onz specimen container | FALCON | 354013 | Other products may also be suitable |
60mm dish | FALCON | 351007 | Other products may also be suitable |
50 x 50 cm sterile drape | HOGY Medical | SR-823 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
Disposable pippete | FALCON | 357575 | Other products may also be suitable |
Fine scissors, Curved | WPI | #14224-G | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
Hot plate | TOKAI HIT | TPiE-SP | Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation |
Human Serum Albumin Solution | Irvine Scientific | 9988 | Medium for handling ovarian tissue |
IVA cannule | KITAZATO | 446030 IVA-6030E | Specific cannula for tissue autografting |
KAI medical Disposable scalpel | WPI | #5 10-A | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
Micro scissors, Curved | WPI | #503364 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
Modified HTF Medium-HEPES | Irvine Scientific | 90126 | Medium for handling ovarian tissue |
Sterile gauze | Osaki Medical | 15004 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
Swiss Tweezers, Curved Tips | KAI | #504505 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |