הנדסה אמינה ושליטה במעגלי גנים אופטוגנטיים יציבים בתאי יונקים
Summary
שליטה אמינה בתאי יונקים מגיבים לאור דורשת סטנדרטיזציה של שיטות אופטוגנטיות. לקראת מטרה זו, מחקר זה מתאר צינור של בניית מעגלי גנים, הנדסת תאים, פעולת ציוד אופטוגנטי, ובדיקות אימות כדי לתקנן את המחקר של ביטוי גנים המושרה באור באמצעות מעגל גנים אופטוגנטי משוב שלילי כמקרה מבחן.
Abstract
שליטה אמינה בביטוי גנים בתאי יונקים דורשת כלים עם שינוי קיפול גבוה, רעש נמוך ופונקציות העברה נחושות של קלט לפלט, ללא קשר לשיטה שבה נעשה שימוש. לקראת מטרה זו, מערכות ביטוי גנים אופטוגנטיות זכו לתשומת לב רבה בעשור האחרון לשליטה מרחבית ברמות החלבון בתאי היונקים. עם זאת, רוב המעגלים הקיימים השולטים בביטוי גנים הנגרמים על ידי אור משתנים בארכיטקטורה, באים לידי ביטוי מפלסמידים, ומשתמשים בציוד אופטוגנטי משתנה, ויוצרים צורך לחקור אפיון ותקינה של רכיבים אופטוגנטיים בשורות תאים יציבים. כאן, המחקר מספק צינור ניסיוני של בניית מעגלי גנים אמינים, אינטגרציה ואפיון לשליטה בביטוי גנים בלתי חדירים לאור בתאי יונקים, תוך שימוש במעגל אופטוגנטי משוב שלילי כדוגמה למקרה. הפרוטוקולים גם ממחישים כיצד סטנדרטיזציה של ציוד אופטוגנטי ומשטרי אור יכולה לחשוף באופן מהימן תכונות מעגל גנים כגון רעש ביטוי גנים וגודל ביטוי חלבון. לבסוף, מאמר זה עשוי להיות שימושי עבור מעבדות שאינן מוכרות עם אופטוגנטיקה המעוניינים לאמץ טכנולוגיה כזו. הצינור המתואר כאן צריך לחול על מעגלים אופטוגנטיים אחרים בתאי יונקים, המאפשרים אפיון אמין ומפורט יותר ושליטה על ביטוי גנים ברמה התמלולית, הפרוטאומית, ובסופו של דבר פנוטיפית בתאי יונקים.
Introduction
בדומה לדיסציפלינות הנדסיות אחרות, ביולוגיה סינתטית שואפת לתקנן פרוטוקולים, ומאפשרת להשתמש בכלים עם פונקציות רב-תכליתיות לשחזור לחקר שאלות הרלוונטיות למערכות ביולוגיות1,2. תחום אחד בביולוגיה סינתטית שבו נבנו מערכות בקרה רבות הוא תחום ויסות ביטוי הגנים3,4. בקרת ביטוי גנים יכולה למקד הן את רמות החלבון והן את השונות (רעש או מקדם וריאציה, CV = σ/μ, הנמדדים כסטיית התקן על הממוצע), שהם מאפיינים תאיים קריטיים בשל תפקידם במצבים תאיים פיזיולוגיים ופתולוגיים5,6,7,8. מערכות סינתטיות רבות שיכולות לשלוט ברמות החלבון וברעש4,9,10,11,12 תוכננו, מה שיוצר הזדמנויות לתקנן פרוטוקולים בכלים שונים.
קבוצה חדשה אחת של כלים שיכולים לשלוט ברשתות גנים שהתפתחה לאחרונה היא אופטוגנטיקה, המאפשרת שימוש באור כדי לשלוט בביטוי הגנים13,14,15,16,17. בדומה לקודמיהם הכימיים, ניתן להכניס מעגלי גנים אופטוגנטיים לכל סוג תא, החל מחיידקים ועד יונקים, המאפשרים ביטוי של כל גן עניין במורד הזרם18,19. עם זאת, בשל הדור המהיר של כלים אופטוגנטיים חדשניים, התפתחו מערכות רבות המשתנות בארכיטקטורת מעגלים גנטיים, מנגנון הביטוי (למשל, מבוסס פלסמיד לעומת שילוב ויראלי), וציוד בקרת אספקת אור11,16,20,21,22,23,24,25 . לכן, זה משאיר מקום לתקנון של תכונות אופטוגנטיות כגון בניית מעגל גנים ואופטימיזציה, שיטת ניצול המערכת (למשל, אינטגרציה לעומת ביטוי חולף), כלים ניסיוניים המשמשים אינדוקציה וניתוח תוצאות.
כדי להתקדם בתקינון פרוטוקולים אופטוגנטיים בתאי יונקים, פרוטוקול זה מתאר צינור ניסיוני להנדס מערכות אופטוגנטיות בתאי יונקים באמצעות מעגל גנים משוב שלילי (NF) המשולב בתאי HEK293 (קו תאי כליה עובריים אנושיים) כדוגמה. NF היא מערכת אידיאלית להדגמת תקינה מכיוון שהיא שופעת מאוד בטבעה 26,27,28, ומאפשרת כוונון רמות חלבון ומזעור רעש להתרחש. בקצרה, NF מאפשר שליטה מדויקת בביטוי גנים על ידי מדכא המפחית את הביטוי שלו מספיק מהר, ובכך מגביל כל שינוי הרחק ממצב יציב. המצב היציב יכול להשתנות על ידי ממריץ כי מנטרל או מבטל את הדיכוי כדי לאפשר ייצור חלבון יותר עד מצב יציב חדש הוא הגיע עבור כל ריכוז ממריץ. לאחרונה, נוצרה מערכת אופטוגנטית מהונדסת של NF שיכולה לייצר תגובה דינמית רחבה של ביטוי גנים, לשמור על רעש נמוך ולהגיב לגירויים קלים המאפשרים את הפוטנציאל לשליטה בביטוי גנים מרחביים11. כלים אלה, המכונים מקלטים בלתי ניתנים למניעה לאור (LITers), נוצרו בהשראת מערכות קודמות שאפשרו שליטה בביטוי גנים בתאים חיים4,10,29,30 ושולבו ביציבות בקווי תאים אנושיים כדי להבטיח שליטה ארוכת טווח בביטוי הגנים.
כאן, באמצעות LITer כדוגמה, פרוטוקול מתואר ליצירת מעגלי גנים מגיבים לאור, גרימת ביטוי גנים עם מנגנון צלחת אור (LPA, חומרת אינדוקציה אופטוגנטית)31, ולנתח את התגובות של קווי התא המהונדסים, האופטוגנטיים לשליטה לגירויים אור מותאמים אישית. פרוטוקול זה מאפשר למשתמשים להשתמש בכלי LITer עבור כל גן פונקציונלי שהם רוצים לחקור. זה יכול להיות מותאם גם עבור מערכות אופטוגנטיות אחרות עם ארכיטקטורות מעגלים מגוונות (למשל, משוב חיובי, רגולציה שלילית, וכו ‘) באמצעות שילוב השיטות וציוד אופטוגנטי המתואר להלן. בדומה לפרוטוקולים אחרים של ביולוגיה סינתטית, ניתן ליישם את הקלטות הווידאו והפרוטוקולים האופטוגנטיים המתוארים כאן במחקרים חד-תאיים בתחומים מגוונים, כולל אך לא מוגבל לביולוגיה של סרטן, התפתחות עוברית ובידול רקמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
קוראי מאמר זה יכולים לקבל תובנה על השלבים החיוניים לאפיון מעגלי גנים אופטוגנטיים (כמו גם מערכות ביטוי גנים אחרות), כולל 1) תכנון מעגלי גנים, בנייה ואימות; 2) הנדסת תאים להכנסת מעגלי גנים לקווי תאים יציבים (למשל, רקומבינציה Flp-FRT); 3) אינדוקציה של התאים המהונדסים עם פלטפורמה מבוססת אור כגון LPA; 4) א…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות למעבדת Balázsi על הערות והצעות, ד”ר קרל פ גרהרדט וד”ר ג’פרי ג ‘תבור על שעזרו לנו לבנות את LPA הראשון, וד”ר וילפריד וובר על שיתוף LOV2-degron plasmids. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [R35 GM122561 ו- T32 GM0084444]; מרכז לאופר לביולוגיה פיזית וכמותית; ומלגת מדע והנדסה של הביטחון הלאומי (NDSEG). מימון לדמי גישה פתוחה: NIH [R35 GM122561].
תרומות מחבר: M.T.G. ו- G.B. הגה את הפרויקט. M.T.G., D.C., ו L.G., ביצע את הניסויים. M.T.G., D.C., L.G., ו- G.B ניתחו את הנתונים והכינו את כתב היד. ג.B ו-אם.טי.ג’י פיקחו על הפרויקט.
Materials
| 0.2 mL PCR tubes | Eppendorf | 951010006 | reagent for carrying out PCR |
| 0.25% Trypsin EDTA 1X | Thermo Fisher Scientific | MT25053CI | reagent for splitting & harvesting mammalian cells |
| 0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000020 | tool used for pipetting reactions |
| 100-1000 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
| 20-200 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000055 | tool used for pipetting reactions |
| 2-20 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
| 5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | reagent for flow cytometry |
| 5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V | Eppendorf | 22628113 | equipment for mammalian culture work |
| Agarose | Denville Scientific | GR140-500 | reagent for gel electrophoresis |
| Aluminum Foils for 96-well Plates | VWR® | 60941-126 | tool used for covering plates in light-induction experiments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9518-5G | reagent for selecting bacteria with correct plasmid |
| Analog vortex mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365PR | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140010 | reagent for growing bacteria |
| BD LSRAria | BD | 656700 | tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations |
| BD LSRFortessa | BD | 649225 | tool for characterizing engineered cell lines |
| BSA, Bovine Serum Albumine | Government Scientific Source | SIGA4919-1G | reagent for IF incubation buffer |
| Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC | Corning | 353043 | plate used for growing monoclonal cells |
| Centrifuge | VWR | 22628113 | instrument for mammalian cell culture |
| Chemical fume hood | N/A | N/A | instrument for carrying out IF reactions |
| Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid | BD | 353047 | plate used for growing monoclonal cells |
| CytoOne T25 filter cap TC flask | USA Scientific | CC7682-4825 | container for growing mammalian cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fischer Scientific | BP231-100 | reagent used for freezing down engineered mammalian cells |
| Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15-585-011 | reagent for gel electrophoresis |
| Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid | Corning | 353072 | container for growing sorted monoclonal cells |
| FCS Express | De Novo Software: | N/A | software for characterizing flow cytometry data |
| Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL | Corning | 35-010-CV | reagent for growing mammalian cells |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | equipment for growing bacteria |
| Gibco DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11-965-092 | reagent for growing mammalian cells |
| Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
| Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL | Life Technologies | 10687-010 | reagent for selecting cells with proper gene circuit integration |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | reagent for converting RNA to cDNA |
| Laboratory Freezer -20 °C | VWR | 76210-392 | equipment for storing experimental reagents |
| Laboratory Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U74VC | equipment for storing experimental reagents |
| Laboratory Refrigerator +4 °C | VWR | 76359-220 | equipment for storing experimental reagents |
| LB Broth (Lennox) , 1 kg | Sigma-Aldrich | L3022-250G | reagent for growing bacteria |
| LIPOFECTAMINE 3000 | Life Technologies | L3000008 | reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells |
| MATLAB 2019 | MathWorks | N/A | software for analyzing experimental data |
| Methanol | Acros Organics | 413775000 | reagent for immunofluorescence reaction |
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL | VWR | 20170-333 | plasticware container |
| Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
| MultiTherm Shaker | Benchmark Scientific | H5000-HC | equipment for bacterial transformation |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-NDL-US-CAN | equipment for DNA/RNA concentration measurement |
| NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix | NEB | M0492S | reagent for PCR of gene circuit fragments |
| NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs (NEB) | C3019H | bacterial cells for amplifying gene circuit of interest |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs (NEB) | E2621L | reagent for combining gene circuit fragements |
| Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera | Nikon Instruments Inc. | N/A | instrument for quantifying gene expression |
| NIS-Elements | Nikon Instruments Inc. | N/A | software for characterizing fluorescence microscopy data |
| oligonucleotides | IDT | N/A | reagent used for PCR of gene circuit components |
| Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control | Panasonic | MCO-170AICUVHL-PA | instrument for growing mammalian cells |
| Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | reagent |
| PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) | Invitrogen | 14190144 | reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x | Fisher Scientific | 15140-122 | reagent for growing mammalian cells |
| primary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 4370S | primary ERK antibody for immunifluorescence |
| primary KRAS antibody | Sigma-Aldrich | WH0003845M1 | primary KRAS antibody for immunifluorescence |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | reagent kit for purifying gene circuit plasmids |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | reagent kit for purifying gene circuit fragments |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Eppendorf | A28137 | equipment for qRT-PCR |
| Relative Quantification App | Thermo Fisher Scientific | N/A | software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | kit for extracting RNA of engineered mammalian cells |
| Secondary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 8889S | secondary ERK antibody for immunifluorescence |
| secondary KRAS antibody | Invitrogen | A11005 | secondary KRAS antibody for immunifluorescence |
| Serological Pipets 5.0 mL | Olympus Plastics | 12-102 | reagents used for setting up a variety of chemical reactions |
| SmartView Pro Imager System | Major Science | UVCI-1200 | tool for imaging correct PCR bands |
| SnapGene Viewer (free) or SnapGene | SnapGene | N/A | software DNA sequence design and analysis |
| Stage top incubator | Tokai Hit | INU-TIZ | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | reagent for PCR of gene circuit fragments |
| TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn | Life Technologies | 4326317E | qPCR Probe |
| Thermocycler | Bio-Rad | 1851148 | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated | PerkinElmer | 1450-605 | plate used for light-induction experiments |
| VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm | VWR | 14673-010 | reagent for mammalian cell culture |
| VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System | VWR | 89032-290 | equipment for DNA gel electrophoresis |
| Flp-In 293 | Thermo Fisher Scientific | R75007 | Engineered cell line with FRT site |
Referências
- Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822 (2018).
- Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
- Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247 (2016).
- Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
- Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
- Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
- Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
- Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
- Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
- Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
- Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
- Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670 (2013).
- Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), 1565-1568 (2011).
- Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18 (2015).
- Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131 (2019).
- Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521 (2018).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547 (2017).
- Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
- Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314 (2019).
- Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
- Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
- Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
- Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111 (2011).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
- Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887 (2018).
- Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
- Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
- Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
- Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
- Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128 (2014).
- Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
- Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591 (2005).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
- Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
- Erlich, H. A. . PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , (1989).
- Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. . The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , (2006).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
- Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849 (2017).
- Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
- Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
- Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
- Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436 (2020).
- Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
- Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , (2020).
- Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766 (2019).
- Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
- Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726 (2020).
- Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
- Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
- Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355 (2020).
