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Bioengenharia

Ingeniería confiable y control de circuitos genéticos optogenéticos estables en células de mamíferos

Published: July 06, 2021
doi:
10.3791/62109
, , ,
1Biomedical Engineering Department,Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology,Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

Summary

El control fiable de las células de mamíferos sensibles a la luz requiere la estandarización de los métodos optogenéticos. Hacia este objetivo, este estudio describe una línea de construcción de circuitos genéticos, ingeniería celular, operación de equipos optogenéticos y ensayos de verificación para estandarizar el estudio de la expresión génica inducida por la luz utilizando un circuito genético optogenético de retroalimentación negativa como estudio de caso.

Abstract

El control confiable de la expresión génica en células de mamíferos requiere herramientas con alto cambio de pliegue, bajo ruido y funciones determinadas de transferencia de entrada a salida, independientemente del método utilizado. Hacia este objetivo, los sistemas de expresión génica optogenética han ganado mucha atención en la última década para el control espaciotemporal de los niveles de proteínas en las células de mamíferos. Sin embargo, la mayoría de los circuitos existentes que controlan la expresión génica inducida por la luz varían en arquitectura, se expresan a partir de plásmidos y utilizan equipos optogenéticos variables, lo que crea la necesidad de explorar la caracterización y estandarización de los componentes optogenéticos en líneas celulares estables. Aquí, el estudio proporciona una línea experimental de construcción, integración y caracterización de circuitos genéticos confiables para controlar la expresión génica inducible por la luz en células de mamíferos, utilizando un circuito optogenético de retroalimentación negativa como ejemplo de caso. Los protocolos también ilustran cómo la estandarización de equipos optogenéticos y regímenes de luz puede revelar de manera confiable las características del circuito génico, como el ruido de expresión génica y la magnitud de la expresión de proteínas. Por último, este documento puede ser de utilidad para los laboratorios que no están familiarizados con la optogenética que deseen adoptar dicha tecnología. La tubería descrita aquí debería aplicarse a otros circuitos optogenéticos en células de mamíferos, lo que permite una caracterización y un control más confiables y detallados de la expresión génica a nivel transcripcional, proteómico y, en última instancia, fenotípico en células de mamíferos.

Introduction

Al igual que otras disciplinas de la ingeniería, la biología sintética tiene como objetivo estandarizar los protocolos, permitiendo utilizar herramientas con funciones altamente reproducibles para explorar cuestiones relevantes para los sistemas biológicos1,2. Un dominio de la biología sintética donde se han construido muchos sistemas de control es el área de regulación de la expresión génica3,4. El control de la expresión génica puede dirigirse tanto a los niveles de proteínas como a la variabilidad (ruido o coeficiente de variación, CV = σ/μ, medido como la desviación estándar sobre la media), que son características celulares cruciales debido a su papel en los estados celulares fisiológicos y patológicos5,6,7,8. Muchos sistemas sintéticos que pueden controlar los niveles de proteínas y el ruido4,9,10,11,12 han sido diseñados, creando oportunidades para estandarizar protocolos en todas las herramientas.

Un nuevo conjunto de herramientas que pueden controlar las redes génicas que ha surgido recientemente es la optogenética, que permite el uso de la luz para controlar la expresión génica13,14,15,16,17. Al igual que sus predecesores químicos, los circuitos genéticos optogenéticos pueden introducirse en cualquier tipo de célula, desde bacterias hasta mamíferos, permitiendo la expresión de cualquier gen de interés aguas abajo18,19. Sin embargo, debido a la rápida generación de nuevas herramientas optogenéticas, han surgido muchos sistemas que varían en la arquitectura del circuito genético, el mecanismo de expresión (por ejemplo, la integración basada en plásmidos frente a la viral) y los equipos de control de suministro de luz11,16,20,21,22,23,24,25 . Por lo tanto, esto deja espacio para la estandarización de las características optogenéticas, como la construcción y optimización de circuitos genéticos, el método de utilización del sistema (por ejemplo, integración frente a expresión transitoria), las herramientas experimentales utilizadas para la inducción y el análisis de resultados.

Para avanzar en la estandarización de protocolos optogenéticos en células de mamíferos, este protocolo describe una tubería experimental para diseñar sistemas optogenéticos en células de mamíferos utilizando un circuito genético de retroalimentación negativa (NF) integrado en células HEK293 (línea celular de riñón embrionario humano) como ejemplo. NF es un sistema ideal para demostrar la estandarización, ya que es muy abundante26,27,28 en la naturaleza, lo que permite ajustar los niveles de proteínas y minimizar el ruido. En resumen, nf permite un control preciso de la expresión génica mediante un represor que reduce su propia expresión lo suficientemente rápido, limitando así cualquier cambio lejos de un estado estacionario. El estado estacionario puede ser alterado por un inductor que inactiva o elimina el represor para permitir una mayor producción de proteínas hasta que se alcanza un nuevo estado estacionario para cada concentración de inductor. Recientemente, se creó un sistema optogenético NF diseñado que puede producir una respuesta ampliamente dinámica de la expresión génica, mantener un ruido bajo y responder a los estímulos de la luz, lo que permite el potencial de control de la expresión génica espacial11. Estas herramientas, conocidas como sintonizadores inducibles por la luz (LITers), se inspiraron en sistemas anteriores que permitían el control de la expresión génica en células vivas4,10,29,30 y se integraron de manera estable en las líneas celulares humanas para garantizar el control de la expresión génica a largo plazo.

Aquí, usando el LITer como ejemplo, se describe un protocolo para crear circuitos genéticos sensibles a la luz, inducir la expresión génica con un Aparato de Placa de Luz (LPA, un hardware de inducción optogenética)31 y analizar las respuestas de las líneas celulares diseñadas y controlables optogenéticamente a estímulos de luz personalizados. Este protocolo permite a los usuarios utilizar las herramientas LITer para cualquier gen funcional que deseen explorar. También se puede adaptar para otros sistemas optogenéticos con diversas arquitecturas de circuitos (por ejemplo, retroalimentación positiva, regulación negativa, etc.) mediante la integración de los métodos y equipos optogenéticos que se describen a continuación. Al igual que otros protocolos de biología sintética, las grabaciones de video y los protocolos optogenéticos descritos aquí se pueden aplicar en estudios unicelulares en diversas áreas, que incluyen, entre otras, la biología del cáncer, el desarrollo embrionario y la diferenciación de tejidos.

Protocol

1. Diseño de circuitos genéticos Seleccionar componentes genéticos para combinarlos en un solo circuito genético/plásmido (por ejemplo, motivos de secuencia de integración de ADN de mamíferos32, elementos sensibles a la luz33 o genes funcionales34). Utilizando cualquier software de ingeniería genética y/o clonación molecular, almacene las secuencias de ADN para su uso y referencia posteriores, anote cada secuencia y exam…

Representative Results

El ensamblaje de circuitos genéticos y la generación de líneas celulares estables dentro de este artículo se basaron en células HEK-293 comerciales modificadas que contienen un sitio FRT estable único y transcripcionalmente activo (Figura 1). Los circuitos genéticos se construyeron en vectores que tenían sitios FRT dentro del plásmido, lo que permitió la integración Flp-FRT en el genoma celular HEK-293. Este enfoque no se limita a las células Flp-In, ya que los sitios FRT se pued…

Discussion

Los lectores de este artículo pueden obtener información sobre los pasos vitales para caracterizar los circuitos genéticos optogenéticos (así como otros sistemas de expresión génica), incluidos 1) el diseño, la construcción y la validación de circuitos genéticos; 2) ingeniería celular para introducir circuitos genéticos en líneas celulares estables (por ejemplo, recombinación Flp-FRT); 3) inducción de las células diseñadas con una plataforma basada en la luz como el LPA; 4) caracterización inicial de e…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer al laboratorio Balázsi por sus comentarios y sugerencias, al Dr. Karl P. Gerhardt y al Dr. Jeffrey J. Tabor por ayudarnos a construir el primer LPA, y al Dr. Wilfried Weber por compartir los plásmidos LOV2-degron. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [R35 GM122561 y T32 GM008444]; El Centro Laufer de Biología Física y Cuantitativa; y una beca de Posgrado en Ciencias e Ingeniería de Defensa Nacional (NDSEG). Financiamiento para el cargo de acceso abierto: NIH [R35 GM122561].

Contribuciones de los autores: M.T.G. y G.B. concibieron el proyecto. M.T.G., D.C. y L.G., realizaron los experimentos. M.T.G., D.C., L.G. y G.B. analizaron los datos y prepararon el manuscrito. G.B. y M.T.G. supervisaron el proyecto.

Materials

0.2 mL PCR tubes Eppendorf 951010006 reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X Thermo Fisher Scientific MT25053CI reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000020 tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000055 tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap Corning 352235 reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V Eppendorf 22628113 equipment for mammalian culture work
Agarose Denville Scientific GR140-500 reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates VWR® 60941-126 tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin Sigma Aldrich A9518-5G reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer Thermo Fisher Scientific 02215365PR tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140010 reagent for growing bacteria
BD LSRAria BD 656700 tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa BD 649225 tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine Government Scientific Source SIGA4919-1G reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC Corning 353043 plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge VWR 22628113 instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood N/A N/A instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid BD 353047 plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask USA Scientific CC7682-4825 container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fischer Scientific BP231-100 reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15-585-011 reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid Corning 353072 container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express De Novo Software: N/A software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL Corning 35-010-CV reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose Thermo Fisher Scientific 11-965-092 reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL Life Technologies 10687-010 reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad Laboratories 1708890 reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C VWR 76210-392 equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C Panasonic MDF-U74VC equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C VWR 76359-220 equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg Sigma-Aldrich L3022-250G reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000 Life Technologies L3000008 reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019 MathWorks N/A software for analyzing experimental data
Methanol Acros Organics 413775000 reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL VWR 20170-333 plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
MultiTherm Shaker Benchmark Scientific H5000-HC equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-NDL-US-CAN equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix NEB M0492S reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs (NEB) C3019H bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs (NEB) E2621L reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera Nikon Instruments Inc. N/A instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements Nikon Instruments Inc. N/A software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides IDT N/A reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control Panasonic MCO-170AICUVHL-PA instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade Electron Microscopy Sciences 15710-S reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) Invitrogen 14190144 reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x Fisher Scientific 15140-122 reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody Cell Signaling Technology 4370S primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody Sigma-Aldrich WH0003845M1 primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Eppendorf A28137 equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App Thermo Fisher Scientific N/A software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody Cell Signaling Technology 8889S secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody Invitrogen A11005 secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL Olympus Plastics 12-102 reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System Major Science UVCI-1200 tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene SnapGene N/A software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator Tokai Hit INU-TIZ tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557 reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn Life Technologies 4326317E qPCR Probe
Thermocycler Bio-Rad 1851148 tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated PerkinElmer 1450-605 plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm VWR 14673-010 reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System VWR 89032-290 equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293 Thermo Fisher Scientific R75007 Engineered cell line with FRT site
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Referências

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Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (173), e62109, doi:10.3791/62109 (2021).
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