El control fiable de las células de mamíferos sensibles a la luz requiere la estandarización de los métodos optogenéticos. Hacia este objetivo, este estudio describe una línea de construcción de circuitos genéticos, ingeniería celular, operación de equipos optogenéticos y ensayos de verificación para estandarizar el estudio de la expresión génica inducida por la luz utilizando un circuito genético optogenético de retroalimentación negativa como estudio de caso.
El control confiable de la expresión génica en células de mamíferos requiere herramientas con alto cambio de pliegue, bajo ruido y funciones determinadas de transferencia de entrada a salida, independientemente del método utilizado. Hacia este objetivo, los sistemas de expresión génica optogenética han ganado mucha atención en la última década para el control espaciotemporal de los niveles de proteínas en las células de mamíferos. Sin embargo, la mayoría de los circuitos existentes que controlan la expresión génica inducida por la luz varían en arquitectura, se expresan a partir de plásmidos y utilizan equipos optogenéticos variables, lo que crea la necesidad de explorar la caracterización y estandarización de los componentes optogenéticos en líneas celulares estables. Aquí, el estudio proporciona una línea experimental de construcción, integración y caracterización de circuitos genéticos confiables para controlar la expresión génica inducible por la luz en células de mamíferos, utilizando un circuito optogenético de retroalimentación negativa como ejemplo de caso. Los protocolos también ilustran cómo la estandarización de equipos optogenéticos y regímenes de luz puede revelar de manera confiable las características del circuito génico, como el ruido de expresión génica y la magnitud de la expresión de proteínas. Por último, este documento puede ser de utilidad para los laboratorios que no están familiarizados con la optogenética que deseen adoptar dicha tecnología. La tubería descrita aquí debería aplicarse a otros circuitos optogenéticos en células de mamíferos, lo que permite una caracterización y un control más confiables y detallados de la expresión génica a nivel transcripcional, proteómico y, en última instancia, fenotípico en células de mamíferos.
Al igual que otras disciplinas de la ingeniería, la biología sintética tiene como objetivo estandarizar los protocolos, permitiendo utilizar herramientas con funciones altamente reproducibles para explorar cuestiones relevantes para los sistemas biológicos1,2. Un dominio de la biología sintética donde se han construido muchos sistemas de control es el área de regulación de la expresión génica3,4. El control de la expresión génica puede dirigirse tanto a los niveles de proteínas como a la variabilidad (ruido o coeficiente de variación, CV = σ/μ, medido como la desviación estándar sobre la media), que son características celulares cruciales debido a su papel en los estados celulares fisiológicos y patológicos5,6,7,8. Muchos sistemas sintéticos que pueden controlar los niveles de proteínas y el ruido4,9,10,11,12 han sido diseñados, creando oportunidades para estandarizar protocolos en todas las herramientas.
Un nuevo conjunto de herramientas que pueden controlar las redes génicas que ha surgido recientemente es la optogenética, que permite el uso de la luz para controlar la expresión génica13,14,15,16,17. Al igual que sus predecesores químicos, los circuitos genéticos optogenéticos pueden introducirse en cualquier tipo de célula, desde bacterias hasta mamíferos, permitiendo la expresión de cualquier gen de interés aguas abajo18,19. Sin embargo, debido a la rápida generación de nuevas herramientas optogenéticas, han surgido muchos sistemas que varían en la arquitectura del circuito genético, el mecanismo de expresión (por ejemplo, la integración basada en plásmidos frente a la viral) y los equipos de control de suministro de luz11,16,20,21,22,23,24,25 . Por lo tanto, esto deja espacio para la estandarización de las características optogenéticas, como la construcción y optimización de circuitos genéticos, el método de utilización del sistema (por ejemplo, integración frente a expresión transitoria), las herramientas experimentales utilizadas para la inducción y el análisis de resultados.
Para avanzar en la estandarización de protocolos optogenéticos en células de mamíferos, este protocolo describe una tubería experimental para diseñar sistemas optogenéticos en células de mamíferos utilizando un circuito genético de retroalimentación negativa (NF) integrado en células HEK293 (línea celular de riñón embrionario humano) como ejemplo. NF es un sistema ideal para demostrar la estandarización, ya que es muy abundante26,27,28 en la naturaleza, lo que permite ajustar los niveles de proteínas y minimizar el ruido. En resumen, nf permite un control preciso de la expresión génica mediante un represor que reduce su propia expresión lo suficientemente rápido, limitando así cualquier cambio lejos de un estado estacionario. El estado estacionario puede ser alterado por un inductor que inactiva o elimina el represor para permitir una mayor producción de proteínas hasta que se alcanza un nuevo estado estacionario para cada concentración de inductor. Recientemente, se creó un sistema optogenético NF diseñado que puede producir una respuesta ampliamente dinámica de la expresión génica, mantener un ruido bajo y responder a los estímulos de la luz, lo que permite el potencial de control de la expresión génica espacial11. Estas herramientas, conocidas como sintonizadores inducibles por la luz (LITers), se inspiraron en sistemas anteriores que permitían el control de la expresión génica en células vivas4,10,29,30 y se integraron de manera estable en las líneas celulares humanas para garantizar el control de la expresión génica a largo plazo.
Aquí, usando el LITer como ejemplo, se describe un protocolo para crear circuitos genéticos sensibles a la luz, inducir la expresión génica con un Aparato de Placa de Luz (LPA, un hardware de inducción optogenética)31 y analizar las respuestas de las líneas celulares diseñadas y controlables optogenéticamente a estímulos de luz personalizados. Este protocolo permite a los usuarios utilizar las herramientas LITer para cualquier gen funcional que deseen explorar. También se puede adaptar para otros sistemas optogenéticos con diversas arquitecturas de circuitos (por ejemplo, retroalimentación positiva, regulación negativa, etc.) mediante la integración de los métodos y equipos optogenéticos que se describen a continuación. Al igual que otros protocolos de biología sintética, las grabaciones de video y los protocolos optogenéticos descritos aquí se pueden aplicar en estudios unicelulares en diversas áreas, que incluyen, entre otras, la biología del cáncer, el desarrollo embrionario y la diferenciación de tejidos.
Los lectores de este artículo pueden obtener información sobre los pasos vitales para caracterizar los circuitos genéticos optogenéticos (así como otros sistemas de expresión génica), incluidos 1) el diseño, la construcción y la validación de circuitos genéticos; 2) ingeniería celular para introducir circuitos genéticos en líneas celulares estables (por ejemplo, recombinación Flp-FRT); 3) inducción de las células diseñadas con una plataforma basada en la luz como el LPA; 4) caracterización inicial de e…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer al laboratorio Balázsi por sus comentarios y sugerencias, al Dr. Karl P. Gerhardt y al Dr. Jeffrey J. Tabor por ayudarnos a construir el primer LPA, y al Dr. Wilfried Weber por compartir los plásmidos LOV2-degron. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [R35 GM122561 y T32 GM008444]; El Centro Laufer de Biología Física y Cuantitativa; y una beca de Posgrado en Ciencias e Ingeniería de Defensa Nacional (NDSEG). Financiamiento para el cargo de acceso abierto: NIH [R35 GM122561].
Contribuciones de los autores: M.T.G. y G.B. concibieron el proyecto. M.T.G., D.C. y L.G., realizaron los experimentos. M.T.G., D.C., L.G. y G.B. analizaron los datos y prepararon el manuscrito. G.B. y M.T.G. supervisaron el proyecto.
0.2 mL PCR tubes | Eppendorf | 951010006 | reagent for carrying out PCR |
0.25% Trypsin EDTA 1X | Thermo Fisher Scientific | MT25053CI | reagent for splitting & harvesting mammalian cells |
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000020 | tool used for pipetting reactions |
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
20-200 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000055 | tool used for pipetting reactions |
2-20 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | reagent for flow cytometry |
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V | Eppendorf | 22628113 | equipment for mammalian culture work |
Agarose | Denville Scientific | GR140-500 | reagent for gel electrophoresis |
Aluminum Foils for 96-well Plates | VWR® | 60941-126 | tool used for covering plates in light-induction experiments |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9518-5G | reagent for selecting bacteria with correct plasmid |
Analog vortex mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365PR | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140010 | reagent for growing bacteria |
BD LSRAria | BD | 656700 | tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations |
BD LSRFortessa | BD | 649225 | tool for characterizing engineered cell lines |
BSA, Bovine Serum Albumine | Government Scientific Source | SIGA4919-1G | reagent for IF incubation buffer |
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC | Corning | 353043 | plate used for growing monoclonal cells |
Centrifuge | VWR | 22628113 | instrument for mammalian cell culture |
Chemical fume hood | N/A | N/A | instrument for carrying out IF reactions |
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid | BD | 353047 | plate used for growing monoclonal cells |
CytoOne T25 filter cap TC flask | USA Scientific | CC7682-4825 | container for growing mammalian cells |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fischer Scientific | BP231-100 | reagent used for freezing down engineered mammalian cells |
Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15-585-011 | reagent for gel electrophoresis |
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid | Corning | 353072 | container for growing sorted monoclonal cells |
FCS Express | De Novo Software: | N/A | software for characterizing flow cytometry data |
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL | Corning | 35-010-CV | reagent for growing mammalian cells |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | equipment for growing bacteria |
Gibco DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11-965-092 | reagent for growing mammalian cells |
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL | Life Technologies | 10687-010 | reagent for selecting cells with proper gene circuit integration |
iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | reagent for converting RNA to cDNA |
Laboratory Freezer -20 °C | VWR | 76210-392 | equipment for storing experimental reagents |
Laboratory Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U74VC | equipment for storing experimental reagents |
Laboratory Refrigerator +4 °C | VWR | 76359-220 | equipment for storing experimental reagents |
LB Broth (Lennox) , 1 kg | Sigma-Aldrich | L3022-250G | reagent for growing bacteria |
LIPOFECTAMINE 3000 | Life Technologies | L3000008 | reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells |
MATLAB 2019 | MathWorks | N/A | software for analyzing experimental data |
Methanol | Acros Organics | 413775000 | reagent for immunofluorescence reaction |
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL | VWR | 20170-333 | plasticware container |
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
MultiTherm Shaker | Benchmark Scientific | H5000-HC | equipment for bacterial transformation |
NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-NDL-US-CAN | equipment for DNA/RNA concentration measurement |
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix | NEB | M0492S | reagent for PCR of gene circuit fragments |
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs (NEB) | C3019H | bacterial cells for amplifying gene circuit of interest |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs (NEB) | E2621L | reagent for combining gene circuit fragements |
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera | Nikon Instruments Inc. | N/A | instrument for quantifying gene expression |
NIS-Elements | Nikon Instruments Inc. | N/A | software for characterizing fluorescence microscopy data |
oligonucleotides | IDT | N/A | reagent used for PCR of gene circuit components |
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control | Panasonic | MCO-170AICUVHL-PA | instrument for growing mammalian cells |
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | reagent |
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) | Invitrogen | 14190144 | reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x | Fisher Scientific | 15140-122 | reagent for growing mammalian cells |
primary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 4370S | primary ERK antibody for immunifluorescence |
primary KRAS antibody | Sigma-Aldrich | WH0003845M1 | primary KRAS antibody for immunifluorescence |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | reagent kit for purifying gene circuit plasmids |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | reagent kit for purifying gene circuit fragments |
QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Eppendorf | A28137 | equipment for qRT-PCR |
Relative Quantification App | Thermo Fisher Scientific | N/A | software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton |
RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | kit for extracting RNA of engineered mammalian cells |
Secondary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 8889S | secondary ERK antibody for immunifluorescence |
secondary KRAS antibody | Invitrogen | A11005 | secondary KRAS antibody for immunifluorescence |
Serological Pipets 5.0 mL | Olympus Plastics | 12-102 | reagents used for setting up a variety of chemical reactions |
SmartView Pro Imager System | Major Science | UVCI-1200 | tool for imaging correct PCR bands |
SnapGene Viewer (free) or SnapGene | SnapGene | N/A | software DNA sequence design and analysis |
Stage top incubator | Tokai Hit | INU-TIZ | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | reagent for PCR of gene circuit fragments |
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn | Life Technologies | 4326317E | qPCR Probe |
Thermocycler | Bio-Rad | 1851148 | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated | PerkinElmer | 1450-605 | plate used for light-induction experiments |
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm | VWR | 14673-010 | reagent for mammalian cell culture |
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System | VWR | 89032-290 | equipment for DNA gel electrophoresis |
Flp-In 293 | Thermo Fisher Scientific | R75007 | Engineered cell line with FRT site |