Pålidelig styring af lysresponsive pattedyrceller kræver standardisering af optogenetiske metoder. Mod dette mål skitserer denne undersøgelse en pipeline af genkredsløbskonstruktion, celleteknik, optogenetisk udstyrsoperation og verifikationsassays for at standardisere undersøgelsen af lysinduceret genekspression ved hjælp af et optogenetisk genkredsløb med negativ feedback som et casestudie.
Pålidelig genekspressionskontrol i pattedyrceller kræver værktøjer med høj foldændring, lav støj og bestemte input-to-output-overførselsfunktioner, uanset hvilken metode der anvendes. Mod dette mål har optogenetiske genekspressionssystemer fået stor opmærksomhed i løbet af det sidste årti for spatiotemporal kontrol af proteinniveauer i pattedyrceller. Imidlertid varierer de fleste eksisterende kredsløb, der styrer lysinduceret genekspression, i arkitektur, udtrykkes fra plasmider og bruger variabelt optogenetisk udstyr, hvilket skaber et behov for at udforske karakterisering og standardisering af optogenetiske komponenter i stabile cellelinjer. Her giver undersøgelsen en eksperimentel pipeline af pålidelig genkredsløbskonstruktion, integration og karakterisering til styring af lysinducerbar genekspression i pattedyrceller ved hjælp af et negativt feedback optogenetisk kredsløb som et case-eksempel. Protokollerne illustrerer også, hvordan standardisering af optogenetisk udstyr og lysregimer pålideligt kan afsløre genkredsløbsfunktioner såsom genekspressionsstøj og proteinekspressionsstørrelse. Endelig kan dette papir være til nytte for laboratorier, der ikke er bekendt med optogenetik, der ønsker at vedtage en sådan teknologi. Den her beskrevne rørledning bør gælde for andre optogenetiske kredsløb i pattedyrceller, hvilket giver mulighed for mere pålidelig, detaljeret karakterisering og kontrol af genekspression på transkriptionelt, proteomisk og i sidste ende fænotypisk niveau i pattedyrceller.
I lighed med andre ingeniørdiscipliner sigter syntetisk biologi mod at standardisere protokoller, hvilket gør det muligt at bruge værktøjer med meget reproducerbare funktioner til at udforske spørgsmål, der er relevante for biologiske systemer1,2. Et domæne inden for syntetisk biologi, hvor mange kontrolsystemer er blevet bygget, er området for genekspressionsregulering3,4. Genekspressionskontrol kan målrette mod både proteinniveauer og variabilitet (støj eller variationskoefficient, CV = σ / μ, målt som standardafvigelsen over gennemsnittet), som er afgørende cellulære egenskaber på grund af deres roller i fysiologiske og patologiske cellulære tilstande5,6,7,8. Mange syntetiske systemer, der kan styre proteinniveauer og støj4,9,10,11,12, er blevet konstrueret, hvilket skaber muligheder for at standardisere protokoller på tværs af værktøjer.
Et nyt sæt værktøjer, der kan kontrollere gennetværk, der for nylig er opstået, er optogenetik, der muliggør brug af lys til at kontrollere genekspression13,14,15,16,17. I lighed med deres kemiske forgængere kan optogenetiske genkredsløb indføres i enhver celletype, lige fra bakterier til pattedyr, hvilket muliggør ekspression af ethvert nedstrøms gen af interesse18,19. På grund af den hurtige generering af nye optogenetiske værktøjer er der imidlertid opstået mange systemer, der varierer i genetisk kredsløbsarkitektur, ekspressionsmekanisme (f.eks. plasmidbaseret vs. viral integration) og lysforsyningskontroludstyr11,16,20,21,22,23,24,25 . Derfor giver dette plads til standardisering af optogenetiske træk såsom genkredsløbskonstruktion og optimering, metode til systemudnyttelse (f.eks. Integration vs. forbigående ekspression), eksperimentelle værktøjer, der anvendes til induktion, og analyse af resultater.
For at gøre fremskridt med at standardisere optogenetiske protokoller i pattedyrceller beskriver denne protokol en eksperimentel pipeline til at konstruere optogenetiske systemer i pattedyrceller ved hjælp af et negativt feedback (NF) genkredsløb integreret i HEK293-celler (human embryonal nyrecellelinje) som et eksempel. NF er et ideelt system til at demonstrere standardisering, da det er meget rigeligt26,27,28 i naturen, hvilket gør det muligt at indstille proteinniveauer og støjminimering at forekomme. Kort fortalt giver NF mulighed for præcis genekspressionskontrol af en repressor, der reducerer sit eget udtryk tilstrækkeligt hurtigt og derved begrænser enhver ændring væk fra en stabil tilstand. Steady state kan ændres af en inducer, der inaktiverer eller eliminerer repressoren for at muliggøre mere proteinproduktion, indtil en ny stabil tilstand er nået for hver inducerkoncentration. For nylig blev der oprettet et konstrueret NF-optogenetisk system, der kan producere et bredt dynamisk respons af genekspression, opretholde lav støj og reagere på lysstimuli, der muliggør potentialet for rumlig genekspressionskontrol11. Disse værktøjer, kendt som lysinducerbare tunere (LITere), blev inspireret af tidligere systemer, der tillod genekspressionskontrol i levende celler4,10,29,30 og blev stabilt integreret i humane cellelinjer for at sikre langsigtet genekspressionskontrol.
Her er der ved hjælp af LITer som et eksempel skitseret en protokol til oprettelse af lysresponsive genkredsløb, inducering af genekspression med et lyspladeapparat (LPA, en optogenetisk induktionshardware)31 og analysere reaktioner fra de konstruerede, optogenetisk kontrollerbare cellelinjer til brugerdefinerede lysstimuli. Denne protokol giver brugerne mulighed for at bruge LITer-værktøjerne til ethvert funktionelt gen, de ønsker at udforske. Det kan også tilpasses til andre optogenetiske systemer med forskellige kredsløbsarkitekturer (f.eks. Positiv feedback, negativ regulering osv.) ved at integrere de metoder og optogenetisk udstyr, der er beskrevet nedenfor. I lighed med andre syntetiske biologiske protokoller kan de videooptagelser og optogenetiske protokoller, der er skitseret her, anvendes i enkeltcellestudier på forskellige områder, herunder, men ikke begrænset til, kræftbiologi, embryonal udvikling og vævsdifferentiering.
Læsere af denne artikel kan få indsigt i de trin, der er afgørende for at karakterisere optogenetiske genkredsløb (såvel som andre genekspressionssystemer), herunder 1) genkredsløbsdesign, konstruktion og validering; 2) celleteknik til introduktion af genkredsløb i stabile cellelinjer (f.eks. Flp-FRT-rekombination); 3) induktion af de konstruerede celler med en lysbaseret platform såsom LPA; 4) indledende karakterisering af lysinduktionsassays via fluorescensmikroskopi; og 5) endelig genekspressionskarakteriserin…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Balázsi lab for kommentarer og forslag, Dr. Karl P. Gerhardt og Dr. Jeffrey J. Tabor for at hjælpe os med at konstruere den første LPA, og Dr. Wilfried Weber for at dele LOV2-degron plasmiderne. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [R35 GM122561 og T32 GM008444]; Laufer Center for Fysisk og Kvantitativ Biologi; og et National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Finansiering af open access-afgift: NIH [R35 GM122561].
Forfatterbidrag: M.T.G. og G.B. udtænkte projektet. M.T.G., D.C. og L.G. udførte eksperimenterne. M.T.G., D.C., L.G. og G.B. analyserede dataene og udarbejdede manuskriptet. G.B. og M.T.G. førte tilsyn med projektet.
0.2 mL PCR tubes | Eppendorf | 951010006 | reagent for carrying out PCR |
0.25% Trypsin EDTA 1X | Thermo Fisher Scientific | MT25053CI | reagent for splitting & harvesting mammalian cells |
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000020 | tool used for pipetting reactions |
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
20-200 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000055 | tool used for pipetting reactions |
2-20 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | reagent for flow cytometry |
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V | Eppendorf | 22628113 | equipment for mammalian culture work |
Agarose | Denville Scientific | GR140-500 | reagent for gel electrophoresis |
Aluminum Foils for 96-well Plates | VWR® | 60941-126 | tool used for covering plates in light-induction experiments |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9518-5G | reagent for selecting bacteria with correct plasmid |
Analog vortex mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365PR | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140010 | reagent for growing bacteria |
BD LSRAria | BD | 656700 | tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations |
BD LSRFortessa | BD | 649225 | tool for characterizing engineered cell lines |
BSA, Bovine Serum Albumine | Government Scientific Source | SIGA4919-1G | reagent for IF incubation buffer |
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC | Corning | 353043 | plate used for growing monoclonal cells |
Centrifuge | VWR | 22628113 | instrument for mammalian cell culture |
Chemical fume hood | N/A | N/A | instrument for carrying out IF reactions |
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid | BD | 353047 | plate used for growing monoclonal cells |
CytoOne T25 filter cap TC flask | USA Scientific | CC7682-4825 | container for growing mammalian cells |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fischer Scientific | BP231-100 | reagent used for freezing down engineered mammalian cells |
Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15-585-011 | reagent for gel electrophoresis |
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid | Corning | 353072 | container for growing sorted monoclonal cells |
FCS Express | De Novo Software: | N/A | software for characterizing flow cytometry data |
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL | Corning | 35-010-CV | reagent for growing mammalian cells |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | equipment for growing bacteria |
Gibco DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11-965-092 | reagent for growing mammalian cells |
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL | Life Technologies | 10687-010 | reagent for selecting cells with proper gene circuit integration |
iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | reagent for converting RNA to cDNA |
Laboratory Freezer -20 °C | VWR | 76210-392 | equipment for storing experimental reagents |
Laboratory Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U74VC | equipment for storing experimental reagents |
Laboratory Refrigerator +4 °C | VWR | 76359-220 | equipment for storing experimental reagents |
LB Broth (Lennox) , 1 kg | Sigma-Aldrich | L3022-250G | reagent for growing bacteria |
LIPOFECTAMINE 3000 | Life Technologies | L3000008 | reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells |
MATLAB 2019 | MathWorks | N/A | software for analyzing experimental data |
Methanol | Acros Organics | 413775000 | reagent for immunofluorescence reaction |
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL | VWR | 20170-333 | plasticware container |
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
MultiTherm Shaker | Benchmark Scientific | H5000-HC | equipment for bacterial transformation |
NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-NDL-US-CAN | equipment for DNA/RNA concentration measurement |
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix | NEB | M0492S | reagent for PCR of gene circuit fragments |
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs (NEB) | C3019H | bacterial cells for amplifying gene circuit of interest |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs (NEB) | E2621L | reagent for combining gene circuit fragements |
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera | Nikon Instruments Inc. | N/A | instrument for quantifying gene expression |
NIS-Elements | Nikon Instruments Inc. | N/A | software for characterizing fluorescence microscopy data |
oligonucleotides | IDT | N/A | reagent used for PCR of gene circuit components |
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control | Panasonic | MCO-170AICUVHL-PA | instrument for growing mammalian cells |
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | reagent |
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) | Invitrogen | 14190144 | reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x | Fisher Scientific | 15140-122 | reagent for growing mammalian cells |
primary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 4370S | primary ERK antibody for immunifluorescence |
primary KRAS antibody | Sigma-Aldrich | WH0003845M1 | primary KRAS antibody for immunifluorescence |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | reagent kit for purifying gene circuit plasmids |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | reagent kit for purifying gene circuit fragments |
QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Eppendorf | A28137 | equipment for qRT-PCR |
Relative Quantification App | Thermo Fisher Scientific | N/A | software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton |
RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | kit for extracting RNA of engineered mammalian cells |
Secondary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 8889S | secondary ERK antibody for immunifluorescence |
secondary KRAS antibody | Invitrogen | A11005 | secondary KRAS antibody for immunifluorescence |
Serological Pipets 5.0 mL | Olympus Plastics | 12-102 | reagents used for setting up a variety of chemical reactions |
SmartView Pro Imager System | Major Science | UVCI-1200 | tool for imaging correct PCR bands |
SnapGene Viewer (free) or SnapGene | SnapGene | N/A | software DNA sequence design and analysis |
Stage top incubator | Tokai Hit | INU-TIZ | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | reagent for PCR of gene circuit fragments |
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn | Life Technologies | 4326317E | qPCR Probe |
Thermocycler | Bio-Rad | 1851148 | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated | PerkinElmer | 1450-605 | plate used for light-induction experiments |
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm | VWR | 14673-010 | reagent for mammalian cell culture |
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System | VWR | 89032-290 | equipment for DNA gel electrophoresis |
Flp-In 293 | Thermo Fisher Scientific | R75007 | Engineered cell line with FRT site |