JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Betrouwbare engineering en controle van stabiele optogenetische gencircuits in zoogdiercellen

Published: July 06, 2021
doi:
10.3791/62109
, , ,
1Biomedical Engineering Department,Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology,Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

Summary

Het betrouwbaar controleren van lichtgevoelige zoogdiercellen vereist de standaardisatie van optogenetische methoden. In de richting van dit doel schetst deze studie een pijplijn van gencircuitconstructie, celtechnologie, optogenetische apparatuur en verificatietests om de studie van door licht geïnduceerde genexpressie te standaardiseren met behulp van een negatief feedback optogenetisch gencircuit als casestudy.

Abstract

Betrouwbare genexpressiecontrole in zoogdiercellen vereist hulpmiddelen met een hoge vouwverandering, weinig ruis en bepaalde input-to-output overdrachtsfuncties, ongeacht de gebruikte methode. In de richting van dit doel hebben optogenetische genexpressiesystemen het afgelopen decennium veel aandacht gekregen voor spatiotemporale controle van eiwitniveaus in zoogdiercellen. De meeste bestaande circuits die lichtgeïnduceerde genexpressie regelen, variëren echter in architectuur, worden uitgedrukt uit plasmiden en maken gebruik van variabele optogenetische apparatuur, waardoor de noodzaak ontstaat om karakterisering en standaardisatie van optogenetische componenten in stabiele cellijnen te onderzoeken. Hier biedt de studie een experimentele pijplijn van betrouwbare gencircuitconstructie, integratie en karakterisering voor het beheersen van licht-induceerbare genexpressie in zoogdiercellen, met behulp van een negatieve feedback optogenetisch circuit als voorbeeld. De protocollen illustreren ook hoe het standaardiseren van optogenetische apparatuur en lichtregimes op betrouwbare wijze gencircuitkenmerken kan onthullen, zoals genexpressieruis en eiwitexpressiegrootheid. Ten slotte kan dit artikel van nut zijn voor laboratoria die niet bekend zijn met optogenetica en die dergelijke technologie willen toepassen. De hier beschreven pijplijn zou van toepassing moeten zijn op andere optogenetische circuits in zoogdiercellen, waardoor een betrouwbaardere, gedetailleerdere karakterisering en controle van genexpressie op transcriptioneel, proteomisch en uiteindelijk fenotypisch niveau in zoogdiercellen mogelijk is.

Introduction

Net als andere technische disciplines heeft synthetische biologie tot doel protocollen te standaardiseren, waardoor hulpmiddelen met zeer reproduceerbare functies kunnen worden gebruikt voor het verkennen van vragen die relevant zijn voor biologische systemen1,2. Een domein in de synthetische biologie waar veel controlesystemen zijn gebouwd, is het gebied van genexpressieregulatie3,4. Genexpressiecontrole kan zich richten op zowel eiwitniveaus als variabiliteit (ruis of variatiecoëfficiënt, CV = σ/μ, gemeten als de standaarddeviatie over het gemiddelde), die cruciale cellulaire kenmerken zijn vanwege hun rol in fysiologische en pathologische cellulaire toestanden5,6,7,8. Veel synthetische systemen die eiwitniveaus pt ruis4,9,10,11,12 kunnen regelen, zijn ontworpen, waardoor mogelijkheden ontstaan om protocollen voor alle tools te standaardiseren.

Een nieuwe set hulpmiddelen die gennetwerken kunnen besturen die onlangs zijn ontstaan, is optogenetica, waardoor het gebruik van licht mogelijk is om genexpressie te regelen13,14,15,16,17. Net als hun chemische voorgangers kunnen optogenetische gencircuits in elk celtype worden geïntroduceerd, variërend van bacteriën tot zoogdieren, waardoor elk stroomafwaarts gen van belang kan worden uitgedrukt18,19. Vanwege de snelle generatie van nieuwe optogenetische hulpmiddelen zijn er echter veel systemen ontstaan die variëren in genetische circuitarchitectuur, expressiemechanisme (bijv. Plasmide-gebaseerde versus virale integratie) en lichtleverende controleapparatuur11,16,20,21,22,23,24,25 . Daarom laat dit ruimte voor standaardisatie van optogenetische kenmerken zoals gencircuitconstructie en -optimalisatie, methode van systeemgebruik (bijv. Integratie versus voorbijgaande expressie), experimentele hulpmiddelen die worden gebruikt voor inductie en analyse van resultaten.

Om vooruitgang te boeken bij het standaardiseren van optogenetische protocollen in zoogdiercellen, beschrijft dit protocol een experimentele pijplijn om optogenetische systemen in zoogdiercellen te engineeren met behulp van een negatief feedback (NF) gencircuit geïntegreerd in HEK293-cellen (menselijke embryonale niercellijn) als voorbeeld. NF is een ideaal systeem om standaardisatie aan te tonen, omdat het zeer overvloedig aanwezig is26,27,28 in de natuur, waardoor eiwitniveaus kunnen worden afgestemd en ruisminimalisatie kan optreden. Kortom, NF maakt nauwkeurige genexpressiecontrole mogelijk door een repressor die zijn eigen expressie voldoende snel vermindert, waardoor elke verandering weg van een steady state wordt beperkt. De steady state kan worden veranderd door een inductor die de repressor inactiveert of elimineert om meer eiwitproductie mogelijk te maken totdat een nieuwe steady state is bereikt voor elke inductorconcentratie. Onlangs is een ontwikkeld NF-optogenetisch systeem gecreëerd dat een breed-dynamische respons van genexpressie kan produceren, lage ruis kan behouden en kan reageren op lichtstimuli, waardoor het potentieel voor ruimtelijke genexpressiecontrole11. Deze hulpmiddelen, bekend als licht-induceerbare tuners (LITers), werden geïnspireerd door eerdere systemen die genexpressiecontrole in levende cellen mogelijk maakten4,10,29,30 en werden stabiel geïntegreerd in menselijke cellijnen om langdurige genexpressiecontrole te garanderen.

Hier, met behulp van de LITer als voorbeeld, wordt een protocol geschetst voor het creëren van lichtresponsieve gencircuits, het induceren van genexpressie met een Light Plate Apparatus (LPA, een optogenetische inductiehardware)31, en het analyseren van reacties van de gemanipuleerde, optogenetisch bestuurbare cellijnen op aangepaste lichtstimuli. Met dit protocol kunnen gebruikers de LITer-tools gebruiken voor elk functioneel gen dat ze willen verkennen. Het kan ook worden aangepast voor andere optogenetische systemen met verschillende circuitarchitecturen (bijv. Positieve feedback, negatieve regulatie, enz.) door de hieronder beschreven methoden en optogenetische apparatuur te integreren. Vergelijkbaar met andere synthetische biologieprotocollen, kunnen de video-opnames en optogenetische protocollen die hier worden beschreven, worden toegepast in eencellige studies op verschillende gebieden, waaronder maar niet beperkt tot kankerbiologie, embryonale ontwikkeling en weefseldifferentiatie.

Protocol

1. Ontwerp van gencircuits Selecteer genetische componenten om te combineren tot een enkel gencircuit/plasmide (bijv. DNA-integratiesequentiemotieven van zoogdieren32, lichtgevoelige elementen33 of functionele genen34). Gebruik genetische manipulatie en/of moleculaire kloonsoftware, sla de DNA-sequenties op voor later gebruik en referentie, annoteer elke sequentie en onderzoek alle noodzakelijke kenmerken (bijv. START-codons, regu…

Representative Results

Gencircuitassemblage en stabiele cellijngeneratie in dit artikel waren gebaseerd op commerciële, gemodificeerde HEK-293-cellen die een transcriptioneel actieve, enkele stabiele FRT-site bevatten (figuur 1). De gencircuits werden geconstrueerd in vectoren met FRT-locaties in het plasmide, waardoor de Flp-FRT-integratie in het HEK-293-celgenoom mogelijk was. Deze aanpak is niet beperkt tot Flp-In-cellen, omdat FRT-sites overal in het genoom aan elke gewenste cellijn kunnen worden toegevoegd m…

Discussion

Lezers van dit artikel kunnen inzicht krijgen in de stappen die van vitaal belang zijn voor het karakteriseren van optogenetische gencircuits (evenals andere genexpressiesystemen), waaronder 1) ontwerp, constructie en validatie van gencircuits; 2) celtechnologie voor het introduceren van gencircuits in stabiele cellijnen (bijv. Flp-FRT-recombinatie); 3) inductie van de gemanipuleerde cellen met een op licht gebaseerd platform zoals de LPA; 4) initiële karakterisering van lichtinductietests via fluorescentiemicroscopie; …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen balázsi lab bedanken voor opmerkingen en suggesties, Dr. Karl P. Gerhardt en Dr. Jeffrey J. Tabor voor het helpen bouwen van de eerste LPA, en Dr. Wilfried Weber voor het delen van de LOV2-degron plasmiden. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [R35 GM122561 en T32 GM008444]; Het Laufer Center for Physical and Quantitative Biology; en een National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Financiering voor open access-kosten: NIH [R35 GM122561].

Bijdragen van de auteur: M.T.G. en G.B. bedachten het project. M.T.G., D.C., en L.G., voerden de experimenten uit. M.T.G., D.C., L.G., en G.B. analyseerden de gegevens en bereidden het manuscript voor. G.B. en M.T.G. begeleidden het project.

Materials

0.2 mL PCR tubes Eppendorf 951010006 reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X Thermo Fisher Scientific MT25053CI reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000020 tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000055 tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap Corning 352235 reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V Eppendorf 22628113 equipment for mammalian culture work
Agarose Denville Scientific GR140-500 reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates VWR® 60941-126 tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin Sigma Aldrich A9518-5G reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer Thermo Fisher Scientific 02215365PR tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140010 reagent for growing bacteria
BD LSRAria BD 656700 tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa BD 649225 tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine Government Scientific Source SIGA4919-1G reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC Corning 353043 plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge VWR 22628113 instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood N/A N/A instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid BD 353047 plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask USA Scientific CC7682-4825 container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fischer Scientific BP231-100 reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15-585-011 reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid Corning 353072 container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express De Novo Software: N/A software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL Corning 35-010-CV reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose Thermo Fisher Scientific 11-965-092 reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL Life Technologies 10687-010 reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad Laboratories 1708890 reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C VWR 76210-392 equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C Panasonic MDF-U74VC equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C VWR 76359-220 equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg Sigma-Aldrich L3022-250G reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000 Life Technologies L3000008 reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019 MathWorks N/A software for analyzing experimental data
Methanol Acros Organics 413775000 reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL VWR 20170-333 plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
MultiTherm Shaker Benchmark Scientific H5000-HC equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-NDL-US-CAN equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix NEB M0492S reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs (NEB) C3019H bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs (NEB) E2621L reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera Nikon Instruments Inc. N/A instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements Nikon Instruments Inc. N/A software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides IDT N/A reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control Panasonic MCO-170AICUVHL-PA instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade Electron Microscopy Sciences 15710-S reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) Invitrogen 14190144 reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x Fisher Scientific 15140-122 reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody Cell Signaling Technology 4370S primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody Sigma-Aldrich WH0003845M1 primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Eppendorf A28137 equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App Thermo Fisher Scientific N/A software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody Cell Signaling Technology 8889S secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody Invitrogen A11005 secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL Olympus Plastics 12-102 reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System Major Science UVCI-1200 tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene SnapGene N/A software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator Tokai Hit INU-TIZ tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557 reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn Life Technologies 4326317E qPCR Probe
Thermocycler Bio-Rad 1851148 tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated PerkinElmer 1450-605 plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm VWR 14673-010 reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System VWR 89032-290 equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293 Thermo Fisher Scientific R75007 Engineered cell line with FRT site
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822 (2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247 (2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670 (2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18 (2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131 (2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521 (2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547 (2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314 (2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111 (2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887 (2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128 (2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591 (2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. . PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. . The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849 (2017).
  48. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  49. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  50. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  51. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  52. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436 (2020).
  53. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  54. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , (2020).
  55. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766 (2019).
  56. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  57. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726 (2020).
  58. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  59. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  60. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355 (2020).

Tags

OptogeneticsGene CircuitsMammalian CellsSpatial-temporal ControlCell EngineeringGene ExpressionCloningTransfectionSingle-cell SortingMonoclonal CellsLPA Circuit3D Printed PartsIris SoftwareLight Stimulation
check_url/pt/62109?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (173), e62109, doi:10.3791/62109 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image