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Bioengenharia

Zuverlässige Entwicklung und Kontrolle stabiler optogenetischer Genschaltkreise in Säugetierzellen

Published: July 06, 2021
doi:
10.3791/62109
, , ,
1Biomedical Engineering Department,Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology,Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

Summary

Die zuverlässige Kontrolle lichtempfindlicher Säugetierzellen erfordert die Standardisierung optogenetischer Methoden. Um dieses Ziel zu erreichen, skizziert diese Studie eine Pipeline von Genschaltkreiskonstruktion, Zelltechnik, optogenetischem Gerätebetrieb und Verifikationsassays, um die Untersuchung der lichtinduzierten Genexpression unter Verwendung eines optogenetischen Genschaltkreises mit negativer Rückkopplung als Fallstudie zu standardisieren.

Abstract

Eine zuverlässige Genexpressionskontrolle in Säugetierzellen erfordert Werkzeuge mit hoher Faltenänderung, geringem Rauschen und bestimmten Input-to-Output-Transferfunktionen, unabhängig von der verwendeten Methode. Um dieses Ziel zu erreichen, haben optogenetische Genexpressionssysteme in den letzten zehn Jahren viel Aufmerksamkeit für die raumzeitliche Kontrolle des Proteinspiegels in Säugetierzellen gewonnen. Die meisten bestehenden Schaltkreise, die die lichtinduzierte Genexpression steuern, variieren jedoch in der Architektur, werden von Plasmiden exprimiert und verwenden variable optogenetische Ausrüstung, was die Notwendigkeit schafft, die Charakterisierung und Standardisierung optogenetischer Komponenten in stabilen Zelllinien zu erforschen. Hier bietet die Studie eine experimentelle Pipeline zuverlässiger Genschaltungskonstruktion, -integration und -charakterisierung zur Kontrolle der lichtinduzierbaren Genexpression in Säugetierzellen, wobei ein optogenetischer Schaltkreis mit negativer Rückkopplung als Fallbeispiel verwendet wird. Die Protokolle veranschaulichen auch, wie die Standardisierung optogenetischer Geräte und Lichtregime Genschaltungsmerkmale wie Genexpressionsrauschen und Proteinexpressionsgröße zuverlässig aufdecken kann. Schließlich kann dieses Papier für Laboratorien von Nutzen sein, die mit Optogenetik nicht vertraut sind und eine solche Technologie anwenden möchten. Die hier beschriebene Pipeline sollte für andere optogenetische Schaltkreise in Säugetierzellen gelten, was eine zuverlässigere, detailliertere Charakterisierung und Kontrolle der Genexpression auf transkriptioneller, proteomischer und letztendlich phänotypischer Ebene in Säugetierzellen ermöglicht.

Introduction

Ähnlich wie andere Ingenieurdisziplinen zielt die synthetische Biologie darauf ab, Protokolle zu standardisieren, so dass Werkzeuge mit hochgradig reproduzierbaren Funktionen zur Untersuchung von Fragen verwendet werden können, die für biologische Systeme relevant sind1,2. Ein Bereich in der synthetischen Biologie, in dem viele Kontrollsysteme aufgebaut wurden, ist der Bereich der Genexpressionsregulation3,4. Die Genexpressionskontrolle kann sowohl auf Proteinspiegel als auch auf Variabilität (Rauschen oder Variationskoeffizient, CV = σ/μ, gemessen als Standardabweichung vom Mittelwert) abzielen, die aufgrund ihrer Rolle in physiologischen und pathologischen Zellzuständen entscheidende zelluläre Merkmale sind5,6,7,8. Viele synthetische Systeme, die den Proteingehalt und das Rauschen4,9,10,11,12 kontrollieren können, wurden entwickelt, um Möglichkeiten zur Standardisierung von Protokollen über Werkzeuge hinweg zu schaffen.

Eine neuartige Reihe von Werkzeugen, die Gennetzwerke kontrollieren können, die kürzlich entstanden sind, ist die Optogenetik, die die Verwendung von Licht zur Kontrolle der Genexpression ermöglicht13,14,15,16,17. Ähnlich wie ihre chemischen Vorgänger können optogenetische Genschaltkreise in jeden Zelltyp eingeführt werden, von Bakterien bis hin zu Säugetieren, was die Expression jedes nachgeschalteten Gens von Interesse ermöglicht18,19. Aufgrund der schnellen Generierung neuartiger optogenetischer Werkzeuge sind jedoch viele Systeme entstanden, die sich in der genetischen Schaltungsarchitektur, dem Expressionsmechanismus (z. B. plasmidbasierte vs. virale Integration) und der lichtversorgenden Kontrollausrüstung unterscheiden11,16,20,21,22,23,24,25 . Daher bleibt Raum für die Standardisierung optogenetischer Merkmale wie Genschaltungsaufbau und -optimierung, Methode der Systemnutzung (z. B. Integration vs. transiente Expression), experimentelle Werkzeuge für die Induktion und Analyse der Ergebnisse.

Um Fortschritte bei der Standardisierung optogenetischer Protokolle in Säugetierzellen zu erzielen, beschreibt dieses Protokoll eine experimentelle Pipeline zur Entwicklung optogenetischer Systeme in Säugetierzellen am Beispiel eines in HEK293-Zellen integrierten Genschaltkreises mit negativem Feedback (NF), der in HEK293-Zellen (humane embryonale Nierenzelllinie) integriert ist. NF ist ein ideales System, um Standardisierung zu demonstrieren, da es in der Natur reichlich vorhanden ist26,27,28, so dass der Proteingehalt abgestimmt und eine Geräuschminimierung erfolgen kann. Kurz gesagt, NF ermöglicht eine präzise Genexprimationskontrolle durch einen Repressor, der seine eigene Expression ausreichend schnell reduziert, wodurch jede Veränderung weg von einem stationären Zustand begrenzt wird. Der stationäre Zustand kann durch einen Induktor verändert werden, der den Repressor inaktiviert oder eliminiert, um eine höhere Proteinproduktion zu ermöglichen, bis für jede Induktorkonzentration ein neuer stationärer Zustand erreicht wird. Vor kurzem wurde ein technisch entwickeltes optogenetisches NF-System entwickelt, das eine breitdynamische Reaktion der Genexpression erzeugen, ein geringes Rauschen aufrechterhalten und auf Lichtreize reagieren kann, was das Potenzial für eine räumliche Genexpressionskontrolle ermöglicht11. Diese Werkzeuge, die als lichtinduzierbare Tuner (LITer) bekannt sind, wurden von früheren Systemen inspiriert, die die Genexpressionskontrolle in lebenden Zellen ermöglichten4,10,29,30 und stabil in menschliche Zelllinien integriert wurden, um eine langfristige Genexpressionskontrolle zu gewährleisten.

Hier wird am Beispiel des LITers ein Protokoll zur Schaffung lichtreaktionsfähiger Genschaltkreise, zur Induktion der Genexpression mit einem Light Plate Apparatus (LPA, einer optogenetischen Induktionshardware)31 und zur Analyse der Reaktionen der manipulierten, optogenetisch kontrollierbaren Zelllinien auf kundenspezifische Lichtreize skizziert. Dieses Protokoll ermöglicht es Benutzern, die LITer-Tools für jedes funktionelle Gen zu verwenden, das sie erforschen möchten. Es kann auch für andere optogenetische Systeme mit unterschiedlichen Schaltungsarchitekturen (z. B. positives Feedback, negative Regulation usw.) angepasst werden, indem die unten beschriebenen Methoden und optogenetischen Geräte integriert werden. Ähnlich wie bei anderen Protokollen der synthetischen Biologie können die hier beschriebenen Videoaufzeichnungen und optogenetischen Protokolle in Einzelzellstudien in verschiedenen Bereichen angewendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Krebsbiologie, Embryonalentwicklung und Gewebedifferenzierung.

Protocol

1. Design von Genschaltkreisen Wählen Sie genetische Komponenten aus, die zu einem einzigen Genschaltkreis/Plasmid kombiniert werden sollen (z. B. Sequenzmotive der DNA-Integration von Säugetieren32, lichtempfindliche Elemente33 oder funktionelle Gene34). Speichern Sie die DNA-Sequenzen zur späteren Verwendung und Referenz mit gentechnischer und/oder molekularer Klonierungssoftware, kommentieren Sie jede Sequenz und untersuchen…

Representative Results

Der Aufbau von Genschaltkreisen und die stabile Zellliniengenerierung in diesem Artikel basierten auf kommerziellen, modifizierten HEK-293-Zellen, die eine transkriptionell aktive, einzelne stabile FRT-Stelle enthielten (Abbildung 1). Die Genschaltkreise wurden zu Vektoren konstruiert, die FRT-Stellen innerhalb des Plasmids hatten, was die Flp-FRT-Integration in das HEK-293-Zellgenom ermöglichte. Dieser Ansatz ist nicht auf Flp-In-Zellen beschränkt, da FRT-Stellen mit DNA-Editing-Technolog…

Discussion

Die Leser dieses Artikels können einen Einblick in die Schritte erhalten, die für die Charakterisierung optogenetischer Genschaltkreise (sowie anderer Genexpressionssysteme) von entscheidender Bedeutung sind, einschließlich 1) Design, Konstruktion und Validierung von Genschaltkreisen; 2) Zell-Engineering zur Einführung von Genschaltkreisen in stabile Zelllinien (z. B. Flp-FRT-Rekombination); 3) Induktion der technischen Zellen mit einer lichtbasierten Plattform wie der LPA; 4) Erstcharakterisierung von Lichtinduktion…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Balázsi lab für Kommentare und Anregungen, Dr. Karl P. Gerhardt und Dr. Jeffrey J. Tabor für die Unterstützung beim Aufbau des ersten LPA und Dr. Wilfried Weber für die gemeinsame Nutzung der LOV2-degron Plasmide. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [R35 GM122561 und T32 GM008444] unterstützt; Das Laufer Zentrum für Physikalische und Quantitative Biologie; und ein National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Finanzierung der Open-Access-Gebühr: NIH [R35 GM122561].

Autorenbeiträge: M.T.G. und G.B. konzipierten das Projekt. M.T.G., D.C., und L.G., führten die Experimente durch. M.T.G., D.C., L.G. und G.B. analysierten die Daten und bereiteten das Manuskript vor. G.B. und M.T.G. betreuten das Projekt.

Materials

0.2 mL PCR tubes Eppendorf 951010006 reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X Thermo Fisher Scientific MT25053CI reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000020 tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000055 tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap Corning 352235 reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V Eppendorf 22628113 equipment for mammalian culture work
Agarose Denville Scientific GR140-500 reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates VWR® 60941-126 tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin Sigma Aldrich A9518-5G reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer Thermo Fisher Scientific 02215365PR tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140010 reagent for growing bacteria
BD LSRAria BD 656700 tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa BD 649225 tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine Government Scientific Source SIGA4919-1G reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC Corning 353043 plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge VWR 22628113 instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood N/A N/A instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid BD 353047 plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask USA Scientific CC7682-4825 container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fischer Scientific BP231-100 reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15-585-011 reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid Corning 353072 container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express De Novo Software: N/A software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL Corning 35-010-CV reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose Thermo Fisher Scientific 11-965-092 reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL Life Technologies 10687-010 reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad Laboratories 1708890 reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C VWR 76210-392 equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C Panasonic MDF-U74VC equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C VWR 76359-220 equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg Sigma-Aldrich L3022-250G reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000 Life Technologies L3000008 reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019 MathWorks N/A software for analyzing experimental data
Methanol Acros Organics 413775000 reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL VWR 20170-333 plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
MultiTherm Shaker Benchmark Scientific H5000-HC equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-NDL-US-CAN equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix NEB M0492S reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs (NEB) C3019H bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs (NEB) E2621L reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera Nikon Instruments Inc. N/A instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements Nikon Instruments Inc. N/A software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides IDT N/A reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control Panasonic MCO-170AICUVHL-PA instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade Electron Microscopy Sciences 15710-S reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) Invitrogen 14190144 reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x Fisher Scientific 15140-122 reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody Cell Signaling Technology 4370S primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody Sigma-Aldrich WH0003845M1 primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Eppendorf A28137 equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App Thermo Fisher Scientific N/A software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody Cell Signaling Technology 8889S secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody Invitrogen A11005 secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL Olympus Plastics 12-102 reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System Major Science UVCI-1200 tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene SnapGene N/A software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator Tokai Hit INU-TIZ tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557 reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn Life Technologies 4326317E qPCR Probe
Thermocycler Bio-Rad 1851148 tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated PerkinElmer 1450-605 plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm VWR 14673-010 reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System VWR 89032-290 equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293 Thermo Fisher Scientific R75007 Engineered cell line with FRT site
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Referências

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Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (173), e62109, doi:10.3791/62109 (2021).
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