Pålitelig kontroll av lysresponsive pattedyrceller krever standardisering av optogenetiske metoder. Mot dette målet skisserer denne studien en rørledning av genkretskonstruksjon, celleteknikk, optogenetisk utstyrsoperasjon og verifikasjonsanalyser for å standardisere studiet av lysindusert genuttrykk ved hjelp av en negativ-feedback optogenetisk genkrets som en casestudie.
Pålitelig genuttrykkskontroll i pattedyrceller krever verktøy med høy foldeendring, lav støy og bestemte input-to-output overføringsfunksjoner, uavhengig av metoden som brukes. Mot dette målet har optogenetiske genuttrykkssystemer fått mye oppmerksomhet det siste tiåret for romlig kontroll av proteinnivåer i pattedyrceller. Imidlertid varierer de fleste eksisterende kretser som kontrollerer lysindusert genuttrykk i arkitektur, uttrykkes fra plasmider, og bruker variabelt optogenetisk utstyr, noe som skaper et behov for å utforske karakterisering og standardisering av optogenetiske komponenter i stabile cellelinjer. Her gir studien en eksperimentell rørledning av pålitelig genkretskonstruksjon, integrasjon og karakterisering for å kontrollere lys-inducible genuttrykk i pattedyrceller, ved hjelp av en negativ feedback optogenetisk krets som eksempel. Protokollene illustrerer også hvordan standardisering av optogenetisk utstyr og lysregimer på en pålitelig måte kan avdekke genkretsfunksjoner som genuttrykksstøy og proteinuttrykksstørrelse. Til slutt kan dette papiret være til nytte for laboratorier som ikke er kjent med optogenetikk som ønsker å ta i bruk slik teknologi. Rørledningen som er beskrevet her, bør søke om andre optogenetiske kretser i pattedyrceller, noe som gir mer pålitelig, detaljert karakterisering og kontroll av genuttrykk ved transkripsjons-, proteomisk og til slutt fenotypisk nivå i pattedyrceller.
I likhet med andre ingeniørdisipliner har syntetisk biologi som mål å standardisere protokoller, slik at verktøy med svært reproduserbare funksjoner kan brukes til å utforske spørsmål som er relevante for biologiske systemer1,2. Et domene i syntetisk biologi der mange kontrollsystemer er bygget er området genuttrykksregulering3,4. Genuttrykkskontroll kan målrette både proteinnivåer og variasjonsevne (støy eller variasjonskoeffisient, CV = σ/μ, målt som standardavviket over gjennomsnittet), som er avgjørende cellulære egenskaper på grunn av deres roller i fysiologiske og patologiske cellulære tilstander5,6,7,8. Mange syntetiske systemer som kan kontrollere proteinnivåer og støy4,9,10,11,12 er utviklet, noe som skaper muligheter til å standardisere protokoller på tvers av verktøy.
Et nytt sett med verktøy som kan kontrollere gennettverk som nylig har dukket opp er optogenetikk, slik at bruk av lys for å kontrollere genuttrykk13,14,15,16,17. I likhet med deres kjemiske forgjengere kan optogenetiske genkretser innføres i enhver celletype, alt fra bakterier til pattedyr, noe som tillater uttrykk for ethvert nedstrøms gen av interesse18,19. På grunn av den raske generasjonen av nye optogenetiske verktøy har det imidlertid oppstått mange systemer som varierer i genetisk kretsarkitektur, uttrykksmekanisme (f.eks. plasmidbasert kontra viral integrasjon) og lysforsyningskontrollutstyr11,16,20,21,22,23,24,25 . Derfor gir dette rom for standardisering av optogenetiske funksjoner som genkretskonstruksjon og optimalisering, metode for systemutnyttelse (f.eks. integrasjon vs. forbigående uttrykk), eksperimentelle verktøy som brukes til induksjon og analyse av resultater.
For å gjøre fremskritt med å standardisere optogenetiske protokoller i pattedyrceller, beskriver denne protokollen en eksperimentell rørledning for å konstruere optogenetiske systemer i pattedyrceller ved hjelp av en negativ feedback (NF) genkrets integrert i HEK293-celler (human embryonal nyrecellelinje) som eksempel. NF er et ideelt system for å demonstrere standardisering siden det er svært rikelig26,27,28 i naturen, slik at proteinnivåer kan justeres og støyminimering kan forekomme. Kort fortalt åpner NF for presis genuttrykkskontroll av en undertrykker som reduserer sitt eget uttrykk tilstrekkelig raskt, og begrenser dermed enhver endring bort fra en jevn tilstand. Steady state kan endres av en induser som inaktiverer eller eliminerer undertrykkeren for å muliggjøre mer proteinproduksjon til en ny steady state er nådd for hver induserkonsentrasjon. Nylig ble det opprettet et konstruert NF optogenetisk system som kan produsere en bred dynamisk respons av genuttrykk, opprettholde lav støy og reagere på lysstimuli som tillater potensialet for romlig genuttrykkskontroll11. Disse verktøyene, kjent som lys-inducible tunere (LITers), ble inspirert av tidligere systemer som tillot genuttrykkskontroll i levende celler4,10,29,30 og ble stabilt integrert i menneskelige cellelinjer for å sikre langsiktig genuttrykkskontroll.
Her, ved hjelp av LITer som eksempel, er en protokoll skissert for å skape lysresponsive genkretser, indusere genuttrykk med et lysplateapparat (LPA, en optogenetisk induksjonsmaskinvare)31, og analysere responsen til de konstruerte, optogenetisk kontrollerbare cellelinjene til tilpassede lysstimuli. Denne protokollen lar brukerne bruke LITer-verktøyene for ethvert funksjonelt gen de ønsker å utforske. Det kan også tilpasses andre optogenetiske systemer med ulike kretsarkitekturer (f.eks. positiv tilbakemelding, negativ regulering, etc.) ved å integrere metodene og optogenetisk utstyr som er skissert nedenfor. I likhet med andre syntetiske biologiprotokoller kan videoopptakene og optogenetiske protokoller som er skissert her, brukes i encellede studier på forskjellige områder, inkludert, men ikke begrenset til, kreftbiologi, embryonal utvikling og vevsdifferensiering.
Lesere av denne artikkelen kan få innsikt i trinnene som er avgjørende for å karakterisere optogenetiske genkretser (så vel som andre genuttrykkssystemer), inkludert 1) genkretsdesign, konstruksjon og validering; 2) celleteknikk for innføring av genkretser i stabile cellelinjer (f.eks. Flp-FRT-rekombinasjon); 3) induksjon av de konstruerte cellene med en lysbasert plattform som LPA; 4) innledende karakterisering av lysinduksjonsanalyser via fluorescensmikroskopi; og 5) endelig genuttrykkskarakterisering med en rekke…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke Balázsi lab for kommentarer og forslag, Dr. Karl P. Gerhardt og Dr. Jeffrey J. Tabor for å hjelpe oss med å konstruere den første LPA, og Dr. Wilfried Weber for å dele LOV2-degron plasmider. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R35 GM122561 og T32 GM008444]; Laufersenteret for fysisk og kvantitativ biologi; og et NDSEG-stipend (National Defense Science and Engineering Graduate). Støtte til åpen tilgang: NIH [R35 GM122561].
Forfatterbidrag: M.T.G. og G.B. unnfanget prosjektet. M.T.G., D.C. og L.G., utførte eksperimentene. M.T.G., D.C., L.G., og G.B. analyserte dataene og utarbeidet manuskriptet. G.B. og M.T.G. ledet prosjektet.
0.2 mL PCR tubes | Eppendorf | 951010006 | reagent for carrying out PCR |
0.25% Trypsin EDTA 1X | Thermo Fisher Scientific | MT25053CI | reagent for splitting & harvesting mammalian cells |
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000020 | tool used for pipetting reactions |
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
20-200 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000055 | tool used for pipetting reactions |
2-20 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | reagent for flow cytometry |
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V | Eppendorf | 22628113 | equipment for mammalian culture work |
Agarose | Denville Scientific | GR140-500 | reagent for gel electrophoresis |
Aluminum Foils for 96-well Plates | VWR® | 60941-126 | tool used for covering plates in light-induction experiments |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9518-5G | reagent for selecting bacteria with correct plasmid |
Analog vortex mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365PR | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140010 | reagent for growing bacteria |
BD LSRAria | BD | 656700 | tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations |
BD LSRFortessa | BD | 649225 | tool for characterizing engineered cell lines |
BSA, Bovine Serum Albumine | Government Scientific Source | SIGA4919-1G | reagent for IF incubation buffer |
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC | Corning | 353043 | plate used for growing monoclonal cells |
Centrifuge | VWR | 22628113 | instrument for mammalian cell culture |
Chemical fume hood | N/A | N/A | instrument for carrying out IF reactions |
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid | BD | 353047 | plate used for growing monoclonal cells |
CytoOne T25 filter cap TC flask | USA Scientific | CC7682-4825 | container for growing mammalian cells |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fischer Scientific | BP231-100 | reagent used for freezing down engineered mammalian cells |
Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15-585-011 | reagent for gel electrophoresis |
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid | Corning | 353072 | container for growing sorted monoclonal cells |
FCS Express | De Novo Software: | N/A | software for characterizing flow cytometry data |
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL | Corning | 35-010-CV | reagent for growing mammalian cells |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | equipment for growing bacteria |
Gibco DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11-965-092 | reagent for growing mammalian cells |
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL | Life Technologies | 10687-010 | reagent for selecting cells with proper gene circuit integration |
iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | reagent for converting RNA to cDNA |
Laboratory Freezer -20 °C | VWR | 76210-392 | equipment for storing experimental reagents |
Laboratory Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U74VC | equipment for storing experimental reagents |
Laboratory Refrigerator +4 °C | VWR | 76359-220 | equipment for storing experimental reagents |
LB Broth (Lennox) , 1 kg | Sigma-Aldrich | L3022-250G | reagent for growing bacteria |
LIPOFECTAMINE 3000 | Life Technologies | L3000008 | reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells |
MATLAB 2019 | MathWorks | N/A | software for analyzing experimental data |
Methanol | Acros Organics | 413775000 | reagent for immunofluorescence reaction |
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL | VWR | 20170-333 | plasticware container |
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
MultiTherm Shaker | Benchmark Scientific | H5000-HC | equipment for bacterial transformation |
NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-NDL-US-CAN | equipment for DNA/RNA concentration measurement |
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix | NEB | M0492S | reagent for PCR of gene circuit fragments |
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs (NEB) | C3019H | bacterial cells for amplifying gene circuit of interest |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs (NEB) | E2621L | reagent for combining gene circuit fragements |
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera | Nikon Instruments Inc. | N/A | instrument for quantifying gene expression |
NIS-Elements | Nikon Instruments Inc. | N/A | software for characterizing fluorescence microscopy data |
oligonucleotides | IDT | N/A | reagent used for PCR of gene circuit components |
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control | Panasonic | MCO-170AICUVHL-PA | instrument for growing mammalian cells |
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | reagent |
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) | Invitrogen | 14190144 | reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x | Fisher Scientific | 15140-122 | reagent for growing mammalian cells |
primary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 4370S | primary ERK antibody for immunifluorescence |
primary KRAS antibody | Sigma-Aldrich | WH0003845M1 | primary KRAS antibody for immunifluorescence |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | reagent kit for purifying gene circuit plasmids |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | reagent kit for purifying gene circuit fragments |
QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Eppendorf | A28137 | equipment for qRT-PCR |
Relative Quantification App | Thermo Fisher Scientific | N/A | software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton |
RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | kit for extracting RNA of engineered mammalian cells |
Secondary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 8889S | secondary ERK antibody for immunifluorescence |
secondary KRAS antibody | Invitrogen | A11005 | secondary KRAS antibody for immunifluorescence |
Serological Pipets 5.0 mL | Olympus Plastics | 12-102 | reagents used for setting up a variety of chemical reactions |
SmartView Pro Imager System | Major Science | UVCI-1200 | tool for imaging correct PCR bands |
SnapGene Viewer (free) or SnapGene | SnapGene | N/A | software DNA sequence design and analysis |
Stage top incubator | Tokai Hit | INU-TIZ | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | reagent for PCR of gene circuit fragments |
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn | Life Technologies | 4326317E | qPCR Probe |
Thermocycler | Bio-Rad | 1851148 | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated | PerkinElmer | 1450-605 | plate used for light-induction experiments |
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm | VWR | 14673-010 | reagent for mammalian cell culture |
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System | VWR | 89032-290 | equipment for DNA gel electrophoresis |
Flp-In 293 | Thermo Fisher Scientific | R75007 | Engineered cell line with FRT site |