Надежное управление светочувствительными клетками млекопитающих требует стандартизации оптогенетических методов. Для достижения этой цели в этом исследовании излагается конвейер построения генной цепи, клеточной инженерии, работы оптогенетического оборудования и проверочных анализов для стандартизации изучения экспрессии генов, индуцированной светом, с использованием оптогенетической генной схемы с отрицательной обратной связью в качестве тематического исследования.
Надежный контроль экспрессии генов в клетках млекопитающих требует инструментов с высоким изменением складки, низким уровнем шума и определенными функциями передачи ввода-вывода, независимо от используемого метода. Для достижения этой цели оптогенетические системы экспрессии генов за последнее десятилетие привлекли большое внимание для пространственно-височного контроля уровня белка в клетках млекопитающих. Однако большинство существующих схем, контролирующих экспрессию генов, индуцированных светом, различаются по архитектуре, экспрессируются из плазмид и используют переменное оптогенетическое оборудование, что создает необходимость изучения характеристик и стандартизации оптогенетических компонентов в стабильных клеточных линиях. Здесь исследование предоставляет экспериментальный конвейер надежного построения генной цепи, интеграции и характеристики для контроля экспрессии генов, индуцируемой светом, в клетках млекопитающих, используя в качестве примера оптогенетическую схему с отрицательной обратной связью. Протоколы также иллюстрируют, как стандартизация оптогенетического оборудования и режимов освещения может надежно выявить особенности генной цепи, такие как шум экспрессии генов и величина экспрессии белка. Наконец, эта статья может быть полезна для лабораторий, незнакомых с оптогенетикой, которые хотят принять такую технологию. Описанный здесь конвейер должен применяться к другим оптогенетическим схемам в клетках млекопитающих, что позволяет более надежно, подробно характеризовать и контролировать экспрессию генов на транскрипционном, протеомном и, в конечном счете, фенотипическом уровне в клетках млекопитающих.
Подобно другим инженерным дисциплинам, синтетическая биология направлена на стандартизацию протоколов, позволяя использовать инструменты с высоковоспроизводимыми функциями для изучения вопросов, относящихся к биологическим системам1,2. Одной из областей в синтетической биологии, где было построено много систем управления, является область регуляции экспрессии генов3,4. Контроль экспрессии генов может быть нацелен как на уровни белка, так и на изменчивость (шум или коэффициент вариации, CV = σ/μ, измеренный как стандартное отклонение от среднего), которые являются важнейшими клеточными характеристиками из-за их роли в физиологических и патологических клеточных состояниях5,6,7,8. Многие синтетические системы, которые могут контролировать уровень белка и шум4,9,10,11,12, были разработаны, создавая возможности для стандартизации протоколов между инструментами.
Одним из новых инструментов, которые могут контролировать генные сети, которые недавно появились, является оптогенетика, позволяющая использовать свет для контроля экспрессии генов13,14,15,16,17. Подобно своим химическим предшественникам, оптогенетические генные цепи могут быть введены в любой тип клеток, начиная от бактерий и заканчивая млекопитающими, что позволяет экспрессировать любой интересующий ген18,19. Однако из-за быстрого создания новых оптогенетических инструментов появилось много систем, которые различаются по архитектуре генетических схем, механизму экспрессии (например, плазмидная и вирусная интеграция) и светоснабжающему контрольному оборудованию11,16,20,21,22,23,24,25 . Таким образом, это оставляет место для стандартизации оптогенетических особенностей, таких как построение и оптимизация генной цепи, метод использования системы (например, интеграция против переходной экспрессии), экспериментальные инструменты, используемые для индукции, и анализ результатов.
Чтобы добиться прогресса в стандартизации оптогенетических протоколов в клетках млекопитающих, этот протокол описывает экспериментальный конвейер для разработки оптогенетических систем в клетках млекопитающих с использованием генной схемы отрицательной обратной связи (NF), интегрированной в клетки HEK293 (клеточная линия эмбриональной почки человека) в качестве примера. NF является идеальной системой для демонстрации стандартизации, поскольку она очень распространена в природе26,27,28, что позволяет настраивать уровни белка и минимизировать шум. Короче говоря, NF позволяет точно контролировать экспрессию генов с помощью репрессора, уменьшая свою собственную экспрессию достаточно быстро, тем самым ограничивая любое изменение от устойчивого состояния. Устойчивое состояние может быть изменено индуктором, который инактивирует или устраняет репрессор, чтобы обеспечить большую выработку белка до тех пор, пока не будет достигнуто новое устойчивое состояние для каждой концентрации индуктора. Недавно была создана спроектированная оптогенетическая система NF, которая может производить широкодинамический ответ экспрессии генов, поддерживать низкий уровень шума и реагировать на световые стимулы, что позволяет контролировать пространственную экспрессию генов11. Эти инструменты, известные как светоиндуцируемые тюнеры (LITers), были вдохновлены более ранними системами, которые позволяли контролировать экспрессию генов в живых клетках4,10,29,30 и были стабильно интегрированы в клеточные линии человека для обеспечения долгосрочного контроля экспрессии генов.
Здесь, используя LITer в качестве примера, описан протокол для создания светочувствительных генных цепей, индуцирующих экспрессию генов с помощью light Plate Apparatus (LPA, оптогенетическое индукционное оборудование)31, и анализа реакций инженерных, оптогенетически контролируемых клеточных линий на пользовательские световые стимулы. Этот протокол позволяет пользователям использовать инструменты LITer для любого функционального гена, который они хотят исследовать. Он также может быть адаптирован для других оптогенетических систем с различными схемными архитектурами (например, положительная обратная связь, отрицательное регулирование и т. Д.) Путем интеграции методов и оптогенетического оборудования, описанных ниже. Подобно другим протоколам синтетической биологии, видеозаписи и оптогенетические протоколы, изложенные здесь, могут применяться в одноклеточных исследованиях в различных областях, включая, но не ограничиваясь биологией рака, эмбриональным развитием и дифференцировкой тканей.
Читатели этой статьи могут получить представление о шагах, жизненно важных для характеристики оптогенетических генных цепей (а также других систем экспрессии генов), включая 1) проектирование, построение и валидацию генных схем; 2) клеточная инженерия для введения генных цепей в стабил?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить лабораторию Балажи за комментарии и предложения, доктора Карла. Герхардта и доктора Джеффри Табора за помощь в создании первого LPA и доктора Вильфрида Вебера за то, что они поделились плазмидами LOV2-дегрона. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [R35 GM122561 и T32 GM008444]; Центр физической и количественной биологии Лауфера; и стипендия для выпускников национальной оборонной науки и техники (NDSEG). Финансирование платы за открытый доступ: NIH [R35 GM122561].
Авторский вклад: M.T.G. и G.B. задумали проект. М.Т.Г., Д.C. и Л.Г. проводили эксперименты. M.T.G., D.C., L.G. и G.B. проанализировали данные и подготовили рукопись. Г.B. и М.Т.Г. руководили проектом.
0.2 mL PCR tubes | Eppendorf | 951010006 | reagent for carrying out PCR |
0.25% Trypsin EDTA 1X | Thermo Fisher Scientific | MT25053CI | reagent for splitting & harvesting mammalian cells |
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000020 | tool used for pipetting reactions |
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
20-200 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000055 | tool used for pipetting reactions |
2-20 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | reagent for flow cytometry |
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V | Eppendorf | 22628113 | equipment for mammalian culture work |
Agarose | Denville Scientific | GR140-500 | reagent for gel electrophoresis |
Aluminum Foils for 96-well Plates | VWR® | 60941-126 | tool used for covering plates in light-induction experiments |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9518-5G | reagent for selecting bacteria with correct plasmid |
Analog vortex mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365PR | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140010 | reagent for growing bacteria |
BD LSRAria | BD | 656700 | tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations |
BD LSRFortessa | BD | 649225 | tool for characterizing engineered cell lines |
BSA, Bovine Serum Albumine | Government Scientific Source | SIGA4919-1G | reagent for IF incubation buffer |
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC | Corning | 353043 | plate used for growing monoclonal cells |
Centrifuge | VWR | 22628113 | instrument for mammalian cell culture |
Chemical fume hood | N/A | N/A | instrument for carrying out IF reactions |
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid | BD | 353047 | plate used for growing monoclonal cells |
CytoOne T25 filter cap TC flask | USA Scientific | CC7682-4825 | container for growing mammalian cells |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fischer Scientific | BP231-100 | reagent used for freezing down engineered mammalian cells |
Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15-585-011 | reagent for gel electrophoresis |
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid | Corning | 353072 | container for growing sorted monoclonal cells |
FCS Express | De Novo Software: | N/A | software for characterizing flow cytometry data |
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL | Corning | 35-010-CV | reagent for growing mammalian cells |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | equipment for growing bacteria |
Gibco DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11-965-092 | reagent for growing mammalian cells |
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL | Life Technologies | 10687-010 | reagent for selecting cells with proper gene circuit integration |
iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | reagent for converting RNA to cDNA |
Laboratory Freezer -20 °C | VWR | 76210-392 | equipment for storing experimental reagents |
Laboratory Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U74VC | equipment for storing experimental reagents |
Laboratory Refrigerator +4 °C | VWR | 76359-220 | equipment for storing experimental reagents |
LB Broth (Lennox) , 1 kg | Sigma-Aldrich | L3022-250G | reagent for growing bacteria |
LIPOFECTAMINE 3000 | Life Technologies | L3000008 | reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells |
MATLAB 2019 | MathWorks | N/A | software for analyzing experimental data |
Methanol | Acros Organics | 413775000 | reagent for immunofluorescence reaction |
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL | VWR | 20170-333 | plasticware container |
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
MultiTherm Shaker | Benchmark Scientific | H5000-HC | equipment for bacterial transformation |
NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-NDL-US-CAN | equipment for DNA/RNA concentration measurement |
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix | NEB | M0492S | reagent for PCR of gene circuit fragments |
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs (NEB) | C3019H | bacterial cells for amplifying gene circuit of interest |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs (NEB) | E2621L | reagent for combining gene circuit fragements |
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera | Nikon Instruments Inc. | N/A | instrument for quantifying gene expression |
NIS-Elements | Nikon Instruments Inc. | N/A | software for characterizing fluorescence microscopy data |
oligonucleotides | IDT | N/A | reagent used for PCR of gene circuit components |
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control | Panasonic | MCO-170AICUVHL-PA | instrument for growing mammalian cells |
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | reagent |
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) | Invitrogen | 14190144 | reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x | Fisher Scientific | 15140-122 | reagent for growing mammalian cells |
primary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 4370S | primary ERK antibody for immunifluorescence |
primary KRAS antibody | Sigma-Aldrich | WH0003845M1 | primary KRAS antibody for immunifluorescence |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | reagent kit for purifying gene circuit plasmids |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | reagent kit for purifying gene circuit fragments |
QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Eppendorf | A28137 | equipment for qRT-PCR |
Relative Quantification App | Thermo Fisher Scientific | N/A | software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton |
RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | kit for extracting RNA of engineered mammalian cells |
Secondary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 8889S | secondary ERK antibody for immunifluorescence |
secondary KRAS antibody | Invitrogen | A11005 | secondary KRAS antibody for immunifluorescence |
Serological Pipets 5.0 mL | Olympus Plastics | 12-102 | reagents used for setting up a variety of chemical reactions |
SmartView Pro Imager System | Major Science | UVCI-1200 | tool for imaging correct PCR bands |
SnapGene Viewer (free) or SnapGene | SnapGene | N/A | software DNA sequence design and analysis |
Stage top incubator | Tokai Hit | INU-TIZ | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | reagent for PCR of gene circuit fragments |
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn | Life Technologies | 4326317E | qPCR Probe |
Thermocycler | Bio-Rad | 1851148 | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated | PerkinElmer | 1450-605 | plate used for light-induction experiments |
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm | VWR | 14673-010 | reagent for mammalian cell culture |
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System | VWR | 89032-290 | equipment for DNA gel electrophoresis |
Flp-In 293 | Thermo Fisher Scientific | R75007 | Engineered cell line with FRT site |