Işığa duyarlı memeli hücrelerini güvenilir bir şekilde kontrol etmek, optogenetik yöntemlerin standardizasyonunu gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, bu çalışma, negatif geri beslemeli bir optogenetik gen devresini vaka çalışması olarak kullanarak ışığa bağlı gen ekspresyonunun çalışmasını standartlaştırmak için gen devresi yapımı, hücre mühendisliği, optogenetik ekipman çalışması ve doğrulama testlerinin bir boru hattını özetlemektedir.
Memeli hücrelerinde güvenilir gen ekspresyon kontrolü, kullanılan yöntemden bağımsız olarak, yüksek katlama değişimi, düşük gürültü ve belirlenmiş giriş-çıkış transfer işlevlerine sahip aletler gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, optogenetik gen ekspresyon sistemleri, memeli hücrelerinde protein seviyelerinin mekansal zamansal kontrolü için son on yılda çok dikkat çekmiştir. Bununla birlikte, ışık kaynaklı gen ekspresyonunu kontrol eden mevcut devrelerin çoğu mimaride farklılık gösterir, plazmidlerden eksprese edilir ve değişken optogenetik ekipman kullanır, bu da kararlı hücre hatlarında optogenetik bileşenlerin karakterizasyonunu ve standardizasyonunu keşfetme ihtiyacı yaratır. Burada, çalışma, memeli hücrelerinde ışıkla indüklenebilir gen ekspresyonunu kontrol etmek için güvenilir gen devresi yapımı, entegrasyonu ve karakterizasyonunun deneysel bir boru hattını sunarak, bir vaka örneği olarak negatif geri beslemeli optogenetik devre kullanmaktadır. Protokoller ayrıca, optogenetik ekipmanın ve ışık rejimlerinin standartlaştırılmasının, gen ekspresyon gürültüsü ve protein ekspresyon büyüklüğü gibi gen devresi özelliklerini nasıl güvenilir bir şekilde ortaya çıkarabileceğini göstermektedir. Son olarak, bu makale optogenetiğe aşina olmayan ve bu teknolojiyi benimsemek isteyen laboratuvarlar için yararlı olabilir. Burada tarif edilen boru hattı, memeli hücrelerindeki diğer optogenetik devreler için geçerli olmalı ve memeli hücrelerinde transkripsiyonel, proteomik ve nihayetinde fenotipik düzeyde gen ekspresyonunun daha güvenilir, ayrıntılı karakterizasyonuna ve kontrolüne izin vermelidir.
Diğer mühendislik disiplinlerine benzer şekilde, sentetik biyoloji de protokolleri standartlaştırmayı ve biyolojik sistemlerle ilgili soruları araştırmak için yüksek oranda tekrarlanabilir işlevlere sahip araçların kullanılmasına izin vermeyi amaçlamaktadır1,2. Sentetik biyolojide birçok kontrol sisteminin inşa edildiği alanlardan biri de gen ekspresyon regülasyonu alanıdır3,4. Gen ekspresyon kontrolü, fizyolojik ve patolojik hücresel durumlardaki rolleri nedeniyle çok önemli hücresel özellikler olan hem protein seviyelerini hem de değişkenliği (gürültü veya varyasyon katsayısı, CV = σ / μ, ortalamanın standart sapması olarak ölçülür) hedefleyebilir5,6,7,8. Protein seviyelerini ve gürültüyü kontrol edebilen birçok sentetik sistem4,9,10,11,12 tasarlanmış ve araçlar arasında protokolleri standartlaştırmak için fırsatlar yaratılmıştır.
Son zamanlarda ortaya çıkan gen ağlarını kontrol edebilen yeni bir araç seti optogenetiktir ve gen ekspresyonunu kontrol etmek için ışığın kullanılmasını sağlar13,14,15,16,17. Kimyasal öncüllerine benzer şekilde, optogenetik gen devreleri, bakterilerden memelilere kadar herhangi bir hücre tipine sokulabilir ve ilgilenilen herhangi bir aşağı akış geninin ekspresyonuna izin verir18,19. Bununla birlikte, yeni optogenetik araçların hızlı bir şekilde üretilmesi nedeniyle, genetik devre mimarisinde, ekspresyon mekanizmasında (örneğin, plazmid bazlı ve viral entegrasyon) ve ışık sağlayan kontrol ekipmanlarında farklılık gösteren birçok sistem ortaya çıkmıştır11,16,20,21,22,23,24,25 . Bu nedenle, bu, gen devresi yapımı ve optimizasyonu, sistem kullanım yöntemi (örneğin, entegrasyon ve geçici ifade), indüksiyon için kullanılan deneysel araçlar ve sonuçların analizi gibi optogenetik özelliklerin standardizasyonu için yer bırakmaktadır.
Memeli hücrelerinde optogenetik protokollerin standartlaştırılmasında ilerleme kaydetmek için, bu protokol, örnek olarak HEK293 hücrelerine (insan embriyonik böbrek hücresi hattı) entegre edilmiş bir negatif geri besleme (NF) gen devresi kullanarak memeli hücrelerinde optogenetik sistemlerin mühendisliğini yapmak için deneysel bir boru hattını açıklamaktadır. NF, standardizasyonu göstermek için ideal bir sistemdir, çünkü doğada oldukça bol miktarda bulunur26,27,28, protein seviyelerinin ayarlanmasına ve gürültünün en aza indirilmesine izin verir. Kısacası, NF, bir baskılayıcı tarafından kendi ekspresyonunu yeterince hızlı bir şekilde azaltarak hassas gen ekspresyon kontrolüne izin verir, böylece herhangi bir değişikliği kararlı bir durumdan uzaklaştırır. Kararlı durum, her bir indükleyici konsantrasyonu için yeni bir kararlı duruma ulaşılana kadar daha fazla protein üretimine izin vermek için baskılayıcıyı inaktive eden veya ortadan kaldıran bir indükleyici tarafından değiştirilebilir. Son zamanlarda, gen ekspresyonunun geniş dinamik bir tepkisini üretebilen, düşük gürültüyü koruyabilen ve mekansal gen ekspresyon kontrolü potansiyeline izin veren ışık uyaranlarına cevap verebilen mühendislik ürünü bir NF optogenetik sistemi oluşturuldu11. Işık kaynaklı tunerler (LITers) olarak bilinen bu araçlar, canlı hücrelerde gen ekspresyon kontrolüne izin veren daha önceki sistemlerden esinlenmiştir4,10,29,30 ve uzun süreli gen ekspresyon kontrolünü sağlamak için insan hücre hatlarına istikrarlı bir şekilde entegre edilmiştir.
Burada, LITer’i örnek olarak kullanarak, ışığa duyarlı gen devreleri oluşturmak, bir Işık Plakası Aparatı (LPA, bir optogenetik indüksiyon donanımı)31 ile gen ekspresyonunu indüklemek ve mühendislik yapılmış, optogenetik olarak kontrol edilebilir hücre hatlarının özel ışık uyaranlarına tepkilerini analiz etmek için bir protokol özetlenmiştir. Bu protokol, kullanıcıların keşfetmek istedikleri herhangi bir işlevsel gen için LITer araçlarını kullanmalarını sağlar. Ayrıca, aşağıda özetlenen yöntemleri ve optogenetik ekipmanı entegre ederek çeşitli devre mimarilerine (örneğin, olumlu geri bildirim, negatif düzenleme vb.) sahip diğer optogenetik sistemler için uyarlanabilir. Diğer sentetik biyoloji protokollerine benzer şekilde, burada özetlenen video kayıtları ve optogenetik protokoller, kanser biyolojisi, embriyonik gelişim ve doku farklılaşması dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli alanlarda tek hücreli çalışmalarda uygulanabilir.
Bu makalenin okuyucuları, optogenetik gen devrelerini (ve diğer gen ekspresyon sistemlerini) karakterize etmek için hayati önem taşıyan adımlar hakkında fikir edinebilirler: 1) gen devresi tasarımı, yapımı ve doğrulanması; 2) gen devrelerini kararlı hücre hatlarına sokmak için hücre mühendisliği (örneğin, Flp-FRT rekombinasyonu); 3) mühendislik hücrelerinin LPA gibi ışık tabanlı bir platformla indüklenmesi; 4) floresan mikroskopi ile ışık indüksiyon tahlillerinin ilk karakterizasyonu; ve…
The authors have nothing to disclose.
Yorum ve önerileriniz için Balázsi laboratuvarına, ilk LPA’yı oluşturmamıza yardımcı oldukları için Dr. Karl P. Gerhardt ve Dr. Jeffrey J. Tabor’a ve LOV2-degron plazmidlerini paylaştıkları için Dr. Wilfried Weber’e teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri [R35 GM122561 ve T32 GM008444]; Laufer Fiziksel ve Kantitatif Biyoloji Merkezi; ve Ulusal Savunma Bilimi ve Mühendisliği Yüksek Lisans (NDSEG) Bursu. Açık erişim ücreti için finansman: NIH [R35 GM122561].
Yazar katkıları: M.T.G. ve G.B. projeyi tasarladı. M.T.G., D.C. ve L.G. deneyleri gerçekleştirdi. M.T.G., D.C., L.G. ve G.B. verileri analiz etmiş ve makaleyi hazırlamıştır. G.B. ve M.T.G. projeyi denetledi.
0.2 mL PCR tubes | Eppendorf | 951010006 | reagent for carrying out PCR |
0.25% Trypsin EDTA 1X | Thermo Fisher Scientific | MT25053CI | reagent for splitting & harvesting mammalian cells |
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000020 | tool used for pipetting reactions |
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
20-200 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000055 | tool used for pipetting reactions |
2-20 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | reagent for flow cytometry |
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V | Eppendorf | 22628113 | equipment for mammalian culture work |
Agarose | Denville Scientific | GR140-500 | reagent for gel electrophoresis |
Aluminum Foils for 96-well Plates | VWR® | 60941-126 | tool used for covering plates in light-induction experiments |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9518-5G | reagent for selecting bacteria with correct plasmid |
Analog vortex mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365PR | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140010 | reagent for growing bacteria |
BD LSRAria | BD | 656700 | tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations |
BD LSRFortessa | BD | 649225 | tool for characterizing engineered cell lines |
BSA, Bovine Serum Albumine | Government Scientific Source | SIGA4919-1G | reagent for IF incubation buffer |
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC | Corning | 353043 | plate used for growing monoclonal cells |
Centrifuge | VWR | 22628113 | instrument for mammalian cell culture |
Chemical fume hood | N/A | N/A | instrument for carrying out IF reactions |
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid | BD | 353047 | plate used for growing monoclonal cells |
CytoOne T25 filter cap TC flask | USA Scientific | CC7682-4825 | container for growing mammalian cells |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fischer Scientific | BP231-100 | reagent used for freezing down engineered mammalian cells |
Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15-585-011 | reagent for gel electrophoresis |
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid | Corning | 353072 | container for growing sorted monoclonal cells |
FCS Express | De Novo Software: | N/A | software for characterizing flow cytometry data |
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL | Corning | 35-010-CV | reagent for growing mammalian cells |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | equipment for growing bacteria |
Gibco DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11-965-092 | reagent for growing mammalian cells |
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL | Life Technologies | 10687-010 | reagent for selecting cells with proper gene circuit integration |
iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | reagent for converting RNA to cDNA |
Laboratory Freezer -20 °C | VWR | 76210-392 | equipment for storing experimental reagents |
Laboratory Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U74VC | equipment for storing experimental reagents |
Laboratory Refrigerator +4 °C | VWR | 76359-220 | equipment for storing experimental reagents |
LB Broth (Lennox) , 1 kg | Sigma-Aldrich | L3022-250G | reagent for growing bacteria |
LIPOFECTAMINE 3000 | Life Technologies | L3000008 | reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells |
MATLAB 2019 | MathWorks | N/A | software for analyzing experimental data |
Methanol | Acros Organics | 413775000 | reagent for immunofluorescence reaction |
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL | VWR | 20170-333 | plasticware container |
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
MultiTherm Shaker | Benchmark Scientific | H5000-HC | equipment for bacterial transformation |
NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-NDL-US-CAN | equipment for DNA/RNA concentration measurement |
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix | NEB | M0492S | reagent for PCR of gene circuit fragments |
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs (NEB) | C3019H | bacterial cells for amplifying gene circuit of interest |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs (NEB) | E2621L | reagent for combining gene circuit fragements |
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera | Nikon Instruments Inc. | N/A | instrument for quantifying gene expression |
NIS-Elements | Nikon Instruments Inc. | N/A | software for characterizing fluorescence microscopy data |
oligonucleotides | IDT | N/A | reagent used for PCR of gene circuit components |
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control | Panasonic | MCO-170AICUVHL-PA | instrument for growing mammalian cells |
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | reagent |
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) | Invitrogen | 14190144 | reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x | Fisher Scientific | 15140-122 | reagent for growing mammalian cells |
primary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 4370S | primary ERK antibody for immunifluorescence |
primary KRAS antibody | Sigma-Aldrich | WH0003845M1 | primary KRAS antibody for immunifluorescence |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | reagent kit for purifying gene circuit plasmids |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | reagent kit for purifying gene circuit fragments |
QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Eppendorf | A28137 | equipment for qRT-PCR |
Relative Quantification App | Thermo Fisher Scientific | N/A | software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton |
RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | kit for extracting RNA of engineered mammalian cells |
Secondary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 8889S | secondary ERK antibody for immunifluorescence |
secondary KRAS antibody | Invitrogen | A11005 | secondary KRAS antibody for immunifluorescence |
Serological Pipets 5.0 mL | Olympus Plastics | 12-102 | reagents used for setting up a variety of chemical reactions |
SmartView Pro Imager System | Major Science | UVCI-1200 | tool for imaging correct PCR bands |
SnapGene Viewer (free) or SnapGene | SnapGene | N/A | software DNA sequence design and analysis |
Stage top incubator | Tokai Hit | INU-TIZ | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | reagent for PCR of gene circuit fragments |
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn | Life Technologies | 4326317E | qPCR Probe |
Thermocycler | Bio-Rad | 1851148 | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated | PerkinElmer | 1450-605 | plate used for light-induction experiments |
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm | VWR | 14673-010 | reagent for mammalian cell culture |
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System | VWR | 89032-290 | equipment for DNA gel electrophoresis |
Flp-In 293 | Thermo Fisher Scientific | R75007 | Engineered cell line with FRT site |