Tillförlitligt konstruera och kontrollera stabila optogenetiska genkretsar i däggdjursceller
Summary
Att på ett tillförlitligt sätt kontrollera ljuskänsliga däggdjursceller kräver standardisering av optogenetiska metoder. Mot detta mål beskriver denna studie en pipeline av genkrets konstruktion, cellteknik, optogenetic utrustning drift och verifiering analyser för att standardisera studien av ljusinducerade genuttryck med hjälp av en negativ-feedback optogenetic genkrets som en fallstudie.
Abstract
Tillförlitlig genuttryckskontroll i däggdjursceller kräver verktyg med hög vikförändring, lågt brus och bestämda överföringsfunktioner från ingång till utgång, oavsett vilken metod som används. Mot detta mål har optogenetiska genuttryckssystem fått mycket uppmärksamhet under det senaste decenniet för spatiotemporal kontroll av proteinnivåer i däggdjursceller. De flesta befintliga kretsar som styr ljusinducerade genuttryck varierar dock i arkitektur, uttrycks från plasmider och använder variabel optogenetisk utrustning, vilket skapar ett behov av att utforska karakterisering och standardisering av optogenetiska komponenter i stabila cellinjer. Här ger studien en experimentell pipeline av tillförlitlig genkretskonstruktion, integration och karakterisering för att kontrollera ljusinducerbart genuttryck i däggdjursceller, med hjälp av en negativ feedback optogenetisk krets som ett exempel. Protokollen illustrerar också hur standardisering av optogenetisk utrustning och ljusregimer på ett tillförlitligt sätt kan avslöja genkretsfunktioner som genuttrycksljud och proteinuttrycksstorlek. Slutligen kan detta dokument vara till nytta för laboratorier som inte känner till optogenetik och som vill använda sådan teknik. Pipelinen som beskrivs här bör gälla för andra optogenetiska kretsar i däggdjursceller, vilket möjliggör mer tillförlitlig, detaljerad karakterisering och kontroll av genuttryck på transkriptionell, proteomisk och i slutändan fenotypisk nivå i däggdjursceller.
Introduction
I likhet med andra tekniska discipliner syftar syntetisk biologi till att standardisera protokoll, så att verktyg med mycket reproducerbara funktioner kan användas för att utforska frågor som är relevanta för biologiska system1,2. En domän inom syntetisk biologi där många styrsystem har byggts är området genuttrycksreglering3,4. Genuttryckskontroll kan rikta in sig på både proteinnivåer och variabilitet (brus eller variationskoefficient, CV = σ/μ, mätt som standardavvikelsen över medelvärdet), som är avgörande cellulära egenskaper på grund av deras roller i fysiologiska och patologiska cellulära tillstånd5,6,7,8. Många syntetiska system som kan kontrollera proteinnivåer och brus4,9,10,11,12 har konstruerats, vilket skapar möjligheter att standardisera protokoll över verktyg.
En ny uppsättning verktyg som kan kontrollera gennätverk som nyligen har uppstått är optogenetik, vilket möjliggör användning av ljus för att kontrollera genuttryck13,14,15,16,17. I likhet med sina kemiska föregångare kan optogenetiska genkretsar införas i alla celltyper, allt från bakterier till däggdjur, vilket möjliggör uttryck för någon nedströmsgen av intresse18,19. På grund av den snabba genereringen av nya optogenetiska verktyg har dock många system uppstått som varierar i genetisk kretsarkitektur, uttrycksmekanism (t.ex. plasmidbaserad kontra viral integration) och ljusförsörjningskontrollutrustning11,16,20,21,22,23,24,25 . Därför lämnar detta utrymme för standardisering av optogenetiska funktioner som genkretskonstruktion och optimering, metod för systemutnyttjande (t.ex. integration kontra transienta uttryck), experimentella verktyg som används för induktion och analys av resultat.
För att göra framsteg med att standardisera optogenetiska protokoll i däggdjursceller beskriver detta protokoll en experimentell pipeline för att konstruera optogenetiska system i däggdjursceller med hjälp av en negativ feedback (NF) genkrets integrerad i HEK293-celler (mänsklig embryonal njurcelllinje) som ett exempel. NF är ett idealiskt system för att demonstrera standardisering eftersom det är mycket rikligt26,27,28 i naturen, vilket gör att proteinnivåer kan justeras och ljudminimering uppstå. Kort sagt, NF möjliggör exakt genuttryckskontroll genom en undertryckare som minskar sitt eget uttryck tillräckligt snabbt, vilket begränsar alla förändringar bort från ett stabilt tillstånd. Steady state kan ändras av en inducerare som inaktiverar eller eliminerar tryckpressorn för att möjliggöra mer proteinproduktion tills ett nytt stabilt tillstånd uppnås för varje inducerarkoncentration. Nyligen skapades ett konstruerat NF optogenetiskt system som kan producera ett brett dynamiskt svar av genuttryck, upprätthålla lågt brus och svara på ljusstimuli som möjliggör potentialen för rumslig genuttryckskontroll11. Dessa verktyg, så kallade ljusinducerbara tuners (LITers), inspirerades av tidigare system som tillät genuttryckskontroll i levande celler4,10,29,30 och var stabilt integrerade i mänskliga cellinjer för att säkerställa långsiktig genuttryckskontroll.
Här, med LITer som exempel, beskrivs ett protokoll för att skapa ljuskänsliga genkretsar, inducera genuttryck med en ljusplattaapparat (LPA, en optogenetisk induktionsmaskinvara)31 och analysera svaren från de konstruerade, optogenetiskt kontrollerbara cellinjerna till anpassade ljusstimuli. Detta protokoll tillåter användare att använda LITer-verktygen för alla funktionella gener de vill utforska. Det kan också anpassas för andra optogenetiska system med olika kretsarkitekturer (t.ex. positiv feedback, negativ reglering etc.) genom att integrera de metoder och optogenetisk utrustning som beskrivs nedan. I likhet med andra syntetiska biologi protokoll, videoinspelningar och optogenetic protokoll beskrivs här kan tillämpas i encellsstudier i olika områden, inklusive men inte begränsat till cancerbiologi, embryonal utveckling och vävnad differentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Läsare av denna artikel kan få insikt i de steg som är avgörande för att karakterisera optogenetiska genkretsar (liksom andra genuttryckssystem), inklusive 1) genkretsdesign, konstruktion och validering; 2) Cellteknik för införande av genkretsar i stabila cellinjer (t.ex. Flp-FRT-rekombination). 3) Induktion av de konstruerade cellerna med en ljusbaserad plattform såsom LPA; 4) Inledande karakterisering av ljusinduktionsanalyser via fluorescensmikroskopi. och 5) slutlig genuttryck karakterisering med en mängd ol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Balázsi lab för kommentarer och förslag, Dr. Karl P. Gerhardt och Dr. Jeffrey J. Tabor för att hjälpa oss att bygga den första LPA, och Dr Wilfried Weber för att dela LOV2-degron plasmids. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health [R35 GM122561 och T32 GM008444].; Laufer centrerar för läkarundersökning och kvantitativ biologi; och ett NDSEG-stipendium (National Defense Science and Engineering). Finansiering av öppen avgift: NIH [R35 GM122561].
Författarbidrag: M.T.G. och G.B. utformade projektet. M.T.G., D.C., och L.G., utförde experimenten. M.T.G., D.C., L.G., och G.B. analyserade data och förberedde manuskriptet. G.B och M.T.G. övervakade projektet.
Materials
| 0.2 mL PCR tubes | Eppendorf | 951010006 | reagent for carrying out PCR |
| 0.25% Trypsin EDTA 1X | Thermo Fisher Scientific | MT25053CI | reagent for splitting & harvesting mammalian cells |
| 0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000020 | tool used for pipetting reactions |
| 100-1000 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
| 20-200 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000055 | tool used for pipetting reactions |
| 2-20 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
| 5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | reagent for flow cytometry |
| 5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V | Eppendorf | 22628113 | equipment for mammalian culture work |
| Agarose | Denville Scientific | GR140-500 | reagent for gel electrophoresis |
| Aluminum Foils for 96-well Plates | VWR® | 60941-126 | tool used for covering plates in light-induction experiments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9518-5G | reagent for selecting bacteria with correct plasmid |
| Analog vortex mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365PR | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140010 | reagent for growing bacteria |
| BD LSRAria | BD | 656700 | tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations |
| BD LSRFortessa | BD | 649225 | tool for characterizing engineered cell lines |
| BSA, Bovine Serum Albumine | Government Scientific Source | SIGA4919-1G | reagent for IF incubation buffer |
| Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC | Corning | 353043 | plate used for growing monoclonal cells |
| Centrifuge | VWR | 22628113 | instrument for mammalian cell culture |
| Chemical fume hood | N/A | N/A | instrument for carrying out IF reactions |
| Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid | BD | 353047 | plate used for growing monoclonal cells |
| CytoOne T25 filter cap TC flask | USA Scientific | CC7682-4825 | container for growing mammalian cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fischer Scientific | BP231-100 | reagent used for freezing down engineered mammalian cells |
| Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15-585-011 | reagent for gel electrophoresis |
| Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid | Corning | 353072 | container for growing sorted monoclonal cells |
| FCS Express | De Novo Software: | N/A | software for characterizing flow cytometry data |
| Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL | Corning | 35-010-CV | reagent for growing mammalian cells |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | equipment for growing bacteria |
| Gibco DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11-965-092 | reagent for growing mammalian cells |
| Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
| Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL | Life Technologies | 10687-010 | reagent for selecting cells with proper gene circuit integration |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | reagent for converting RNA to cDNA |
| Laboratory Freezer -20 °C | VWR | 76210-392 | equipment for storing experimental reagents |
| Laboratory Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U74VC | equipment for storing experimental reagents |
| Laboratory Refrigerator +4 °C | VWR | 76359-220 | equipment for storing experimental reagents |
| LB Broth (Lennox) , 1 kg | Sigma-Aldrich | L3022-250G | reagent for growing bacteria |
| LIPOFECTAMINE 3000 | Life Technologies | L3000008 | reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells |
| MATLAB 2019 | MathWorks | N/A | software for analyzing experimental data |
| Methanol | Acros Organics | 413775000 | reagent for immunofluorescence reaction |
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL | VWR | 20170-333 | plasticware container |
| Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
| MultiTherm Shaker | Benchmark Scientific | H5000-HC | equipment for bacterial transformation |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-NDL-US-CAN | equipment for DNA/RNA concentration measurement |
| NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix | NEB | M0492S | reagent for PCR of gene circuit fragments |
| NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs (NEB) | C3019H | bacterial cells for amplifying gene circuit of interest |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs (NEB) | E2621L | reagent for combining gene circuit fragements |
| Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera | Nikon Instruments Inc. | N/A | instrument for quantifying gene expression |
| NIS-Elements | Nikon Instruments Inc. | N/A | software for characterizing fluorescence microscopy data |
| oligonucleotides | IDT | N/A | reagent used for PCR of gene circuit components |
| Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control | Panasonic | MCO-170AICUVHL-PA | instrument for growing mammalian cells |
| Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | reagent |
| PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) | Invitrogen | 14190144 | reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x | Fisher Scientific | 15140-122 | reagent for growing mammalian cells |
| primary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 4370S | primary ERK antibody for immunifluorescence |
| primary KRAS antibody | Sigma-Aldrich | WH0003845M1 | primary KRAS antibody for immunifluorescence |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | reagent kit for purifying gene circuit plasmids |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | reagent kit for purifying gene circuit fragments |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Eppendorf | A28137 | equipment for qRT-PCR |
| Relative Quantification App | Thermo Fisher Scientific | N/A | software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | kit for extracting RNA of engineered mammalian cells |
| Secondary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 8889S | secondary ERK antibody for immunifluorescence |
| secondary KRAS antibody | Invitrogen | A11005 | secondary KRAS antibody for immunifluorescence |
| Serological Pipets 5.0 mL | Olympus Plastics | 12-102 | reagents used for setting up a variety of chemical reactions |
| SmartView Pro Imager System | Major Science | UVCI-1200 | tool for imaging correct PCR bands |
| SnapGene Viewer (free) or SnapGene | SnapGene | N/A | software DNA sequence design and analysis |
| Stage top incubator | Tokai Hit | INU-TIZ | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | reagent for PCR of gene circuit fragments |
| TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn | Life Technologies | 4326317E | qPCR Probe |
| Thermocycler | Bio-Rad | 1851148 | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated | PerkinElmer | 1450-605 | plate used for light-induction experiments |
| VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm | VWR | 14673-010 | reagent for mammalian cell culture |
| VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System | VWR | 89032-290 | equipment for DNA gel electrophoresis |
| Flp-In 293 | Thermo Fisher Scientific | R75007 | Engineered cell line with FRT site |
Referências
- Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822 (2018).
- Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
- Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247 (2016).
- Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
- Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
- Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
- Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
- Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
- Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
- Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
- Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
- Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670 (2013).
- Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), 1565-1568 (2011).
- Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18 (2015).
- Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131 (2019).
- Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521 (2018).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547 (2017).
- Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
- Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314 (2019).
- Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
- Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
- Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
- Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111 (2011).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
- Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887 (2018).
- Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
- Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
- Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
- Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
- Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128 (2014).
- Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
- Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591 (2005).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
- Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
- Erlich, H. A. . PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , (1989).
- Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. . The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , (2006).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
- Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849 (2017).
- Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
- Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
- Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
- Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436 (2020).
- Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
- Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , (2020).
- Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766 (2019).
- Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
- Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726 (2020).
- Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
- Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
- Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355 (2020).
