Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

Summary

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil para la modificación de la expresión génica de forma espaciotemporal controlada que permite el análisis genético funcional en Anopheles gambiae. Los procedimientos descritos para el uso de este sistema son una estrategia de clonación semi-estandarizada, sexado y cribado de pupas para marcadores de proteínas fluorescentes y fijación embrionaria.

Abstract

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil y potente para el análisis genético funcional. La esencia del sistema es cruzar líneas transgénicas “conductoras” que expresan el factor de transcripción de levadura GAL4 de una manera específica del tejido, con líneas transgénicas “respondedoras” que llevan una construcción candidata de interferencia de gen / ARN cuya expresión está controlada por secuencias de activación ascendentes (UAS) que se unen a GAL4. En la progenie subsiguiente, el gen o la construcción silenciadora se expresa de una manera espaciotemporal prescrita, lo que permite ensayar los fenotipos resultantes e inferir la función génica. El sistema binario permite flexibilidad en los enfoques experimentales para detectar fenotipos generados por la expresión transgénica en múltiples patrones específicos de tejidos, incluso si se inducen costos severos de aptitud física. Hemos adaptado este sistema para Anopheles gambiae, el principal vector de malaria en África.

En este artículo, proporcionamos algunos de los procedimientos comunes utilizados durante el análisis GAL4-UAS. Describimos las líneas GAL4-UAS de An. gambiae ya generadas, así como la clonación de nuevas construcciones de respuesta para la regulación ascendente y el derribo de ARNi. Especificamos una guía paso a paso para el sexado de pupas de mosquitos para establecer cruces genéticos, que también incluye la detección de la progenie para seguir la herencia de marcadores genéticos fluorescentes que etiquetan las inserciones del conductor y del respondedor. También presentamos un protocolo para la limpieza de embriones de An. gambiae para estudiar el desarrollo embrionario. Finalmente, introducimos posibles adaptaciones del método para generar líneas conductoras a través de la inserción CRISPR/Cas9 de GAL4 aguas abajo de los genes diana.

Introduction

El sistema bipartito GAL4-UAS es el caballo de batalla de la caracterización funcional de genes en el organismo modelo de insectos Drosophila melanogaster1,2,3. Para utilizar el sistema GAL4-UAS, las líneas conductoras transgénicas, que expresan el factor de transcripción de levadura GAL4 bajo control de una secuencia reguladora, se cruzan con líneas de respuesta que llevan un gen de interés o construcción de interferencia de ARN (RNAi) controlada por una secuencia de activación ascendente (UAS) reconocida por GAL4. La progenie de este cruce expresa el transgén de interés en un patrón espaciotemporal dictado por el promotor que controla la expresión de GAL4 (Figura 1). Los fenotipos mostrados por la progenie de los cruces conductor-respondedor se pueden evaluar para dilucidar la función de los genes candidatos. Aunque D. melanogaster se ha utilizado para examinar genes de otros organismos4,5,6,7, el sistema GAL4-UAS ha sido adaptado para su uso en insectos de importancia médica y agrícola para proporcionar un análisis directo en las especies de interés 8,9,10,11,12,13,14.

En el mosquito africano de la malaria, Anopheles gambiae, el sistema GAL4-UAS se probó por primera vez mediante la coinfección de líneas ^celulares9. Se ensayaron múltiples construcciones para determinar la eficiencia en diferentes combinaciones por pares y se encontró que 14 UAS repetidos en tándem complementados con un pequeño intrón artificial (UAS-14i) mostraron el rango más amplio de potencial de activación cuando se usaron con un panel de controladores GAL4. Para demostrar la funcionalidad in vivo, estos constructos se utilizaron para crear dos líneas transgénicas separadas de An. gambiae mediante transformación de ^PiggyBac8: una línea conductora que transporta GAL4 impulsada por un promotor específico del intestino medio, y una línea de respuesta que contiene tanto la luciferasa como los genes de proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP) bajo regulación de secuencias de UAS. La actividad de la luciferasa específica intestinal y la fluorescencia en la progenie indicaron que el sistema era eficiente en Anopheles. Desde entonces, se han creado líneas conductoras que expresan transgenes en otros tejidos importantes para la capacidad vectorial y la resistencia a los insecticidas, incluidos los ^enocitos15 y ^hemocitos16, y en un patrón casi ubicuo10. También se han generado numerosas líneas de UAS para evaluar genes que se cree que están involucrados en el metabolismo y la resistencia a insecticidas mediada por el secuestro, la síntesis de hidrocarburos cuticulares y para etiquetar fluorescentemente diferentes tipos de células y tejidos (Tabla 1). Para las líneas de respuesta, la integración dirigida al sitio del transgén ahora se realiza mediante el intercambio de casetes de recombinación catalizados por ΦC311111111 ^{para fijar} el contexto genómico de los genes regulados por UAS. De esta manera, la expresión transgénica se normaliza con respecto a la ubicación de la inserción genómica, lo que permite una comparación más precisa de los efectos fenotípicos de diferentes genes candidatos.

Las líneas de respuesta creadas hasta la fecha están diseñadas para expresar el transgén a niveles elevados o para reducir la expresión génica a través de la interferencia de ARN (ARNi). Por lo general, los clones de ADNc se fusionan con la secuencia UAS para generar plásmidos de expresión adecuados, sin embargo, las secuencias genómicas completas también son factibles suponiendo que no sean demasiado grandes para la clonación. Para generar construcciones silenciadoras, hemos utilizado tres métodos diferentes para obtener secuencias invertidas en tándem adecuadas que forman dsRNA de horquilla que estimula el ARNi. Estos han incluido PCR de fusión, PCR asimétrica y síntesis comercial de construcciones de horquilla. Común a cada método es la inclusión de una secuencia de intrón entre las secuencias invertidas para proporcionar estabilidad de clonación. Se han desarrollado plásmidos respondedores en los que se puede insertar un gen de interés/construcción de ^ARNi15. Estos plásmidos también llevan los sitios attB ΦC31 requeridos para RMCE (descritos en el artículo de Adolfi que acompaña a JoVE que describe la técnica RCME en detalle). En este manuscrito se incluyen protocolos que cubren los pasos importantes requeridos al seleccionar la secuencia para la inserción en uno de estos plásmidos para la sobreexpresión. Además, se describen e ilustran dos protocolos para la creación de construcciones de horquillas de RNAi.

Al crear nuevas líneas, la identificación de individuos transgénicos raros es crucial para reproducirse para establecer y mantener colonias transgénicas. Lo más importante para el sistema GAL4-UAS es la necesidad de distinguir las líneas de respuesta y conductor para establecer cruces e identificar la progenie individual que transporta ambos transgenes. Esto se logra mediante el uso de diferentes genes marcadores seleccionables dominantes vinculados a los casetes del conductor y del respondedor. Más comúnmente, estos son genes marcadores fluorescentes que son claramente distinguibles utilizando filtros ópticos (por ejemplo, eYFP, eCFP, dsRed). Es importante que los marcadores se expresen en un patrón espaciotemporal conocido y confiable, ya que esto facilita la identificación de anomalías y contaminación. La expresión génica del marcador fluorescente es regulada rutinariamente por el promotor sintético 3xP3, que causa la expresión específica de los ganglios oculares y ventrales en todas las etapas del desarrollo de An. gambiae19. Los marcadores fluorescentes controlados por 3xP3 se incluyen en todos los plásmidos de transformación descritos en este artículo. Aquí se incluye un protocolo que detalla los métodos comunes utilizados para detectar líneas fluorescentes an. gambiae pupae GAL4-UAS.

Uno de los elementos clave del sistema GAL4-UAS es la necesidad de cruzar las líneas de conductor y respuesta marcadas diferencialmente. Para hacer esto, los machos y las hembras de cada línea deben separarse antes del apareamiento. Los adultos son fácilmente distinguibles por la vista, sin embargo, para establecer cruces genéticos es sensato separar los sexos antes de la aparición adulta para garantizar que no se haya producido el apareamiento. La diferencia general de tamaño entre las pupas de An. gambiae macho y hembra es demasiado variable para ser un método eficiente y confiable de determinación del ^sexo20. En cambio, las claras diferencias morfológicas en los genitales externos proporcionan una base confiable para el sexado en An. gambiae. En este artículo, describimos un método confiable para sexar pupas de An. gambiae para establecer cruces apropiados.

Figura 1 – Representación esquemática del proceso para el uso del sistema bipartito GAL4-UAS en Anopheles gambiae. (A) Se representan los componentes principales de un vector de ejemplo (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]), detallando los sitios de restricción disponibles (EcoRI, NheI, XhoI y NcoI) dentro de los múltiples sitios de clonación que son adecuados para su uso para insertar la construcción de horquilla o la secuencia de codificación para el gen de interés. También se representa la estructura de la línea de acoplamiento. (B) El paso de cruce se ilustra indicando el uso de machos de la línea del conductor (que transportan al conductor GAL4 por un promotor de interés y eCFP impulsado por el promotor 3xP3) y hembras de la línea de respuesta (portadores del gen de interés o construcción de horquilla controlada por un promotor de UAS y un marcador eYFP controlado por el promotor 3xP3). (C) Una representación esquemática de GAL4 que impulsa la expresión del gen de interés en la progenie de la cruz en B y una lista de algunos de los fenotipos típicos que se evalúan. Abreviaturas: Sitio de clonación múltiple (MCS), Intercambio de casete mediado por recombinasa (RMCE), Secuencia del activador ascendente (UAS), Proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP), Proteína fluorescente cian mejorada (eCFP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Es el uso de cruces lo que proporciona la naturaleza bipartita del sistema GAL4-UAS, que tiene claras ventajas sobre los enfoques más lineales. Por ejemplo, se pueden evaluar muchas más combinaciones de líneas de conductor y respuesta de lo que sería factible si se tuviera que generar y mantener una nueva línea transgénica para cada combinación promotor/gen. Más importante aún, permite el análisis de genes que producen fenotipos letales o estériles cuando se perturba su expresión que son difíciles de crear/mantener en un sistema lineal. Tales fenotipos letales pueden manifestarse en todas las etapas del desarrollo, dependiendo de la función génica y la expresión espaciotemporal, pero se observan con mayor frecuencia durante el desarrollo embrionario. Visualizar el desarrollo embrionario del mosquito requiere la limpieza del corion opaco que recubre los huevos. Siguiendo los métodos descritos en Trpiš (1970)²¹ y Kaiser et al. (2014)²², describimos los protocolos que utilizamos para fijar embriones, manteniendo la integridad estructural, y el blanqueamiento para despejar el endodocoro que permite la visualización microscópica y la obtención de imágenes.

Protocol

1. Diseño y construcción de construcciones de UAS Diseño y montaje de vectores para la expresión génica candidata Determinar la secuencia que se utilizará para la regulación ascendente de genes candidatos. Secuenciar el ADNc/ADNc a partir de la cepa de interés y compararlo con la secuencia publicada para verificar su identidad e identificar posibles SNP y sitios de restricción para la digestión diagnóstica. Asegúrese de que el cebador d…

Representative Results

La expresión 3xP3 de eYFP, dsRed y eCFP proporciona una identificación confiable y fácilmente distinguible de individuos que poseen los genes marcadores que producen expresión en los ojos y los ganglios ventrales de las pupas de An. gambiae (Figura 3). La morfología diferencial observada en los genitales externos masculinos y femeninos utilizados para el sexado y un ejemplo de pupas no identificables se destacan en la Figura 4. La eliminac…

Discussion

Comprender la función genética de los mosquitos es vital para desarrollar nuevos enfoques para controlar Anopheles e impactar la transmisión de la malaria. El sistema GAL4-UAS descrito es un sistema versátil y potente para el análisis funcional de genes candidatos y hasta la fecha hemos utilizado el sistema para examinar las bases genéticas de la resistencia a ^{insecticidas17} y la producción de hidrocarburos ^{cuticulares15,23}…

Materials

100 x 15 mm plastic Petri dish	SLS	2175546	Pack of 10
1000 µL Gilson Pipette	Gilson	F144059P
20/25 mL Universal Tubes	Starlab	E1412-3020	Pack of 400
3 mL Pasteur Pipettes	SLS	G612398	Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped
50 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	11512303
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-500	500 mL
Acetic Acid	SLS	45726-1L-F	1 L
Cages	SLS	E6099	30x30x30 with screen port
Fine Paint Brushes	Amazon	UKDPB66	KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)
Fish food	Amazon		Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L
Formaldehyde Solution	Sigma Aldrich	F8775
Mouth Aspirator	John Hock	612
Pond Salt	Amazon		Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L
Pupae Pots	Cater4you	SP8OZ	250 pots with lids
Small Plastic Buckets	Amazon		2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10)
Sodium Hypochlorite	Fisher Scientific	S25552