Оценка рассеивания биопленки в мышиных ранах

Summary

Здесь мы описываем методы ex vivo и in vivo для оценки распространения бактерий от раневой инфекции у мышей. Этот протокол может быть использован для проверки эффективности местной антимикробной и антибиопленковой терапии или для оценки рассеивательной способности различных бактериальных штаммов или видов.

Abstract

Инфекции, связанные с биопленкой, связаны с широким спектром хронических состояний, таких как незаживающие диабетические язвы стопы, хронический синусит, повторяющийся средний отит и многие другие. Микробные клетки в этих инфекциях защищены внеклеточным полимерным веществом (EPS), которое может предотвратить антибиотики и иммунные клетки хозяина от очистки инфекции. Чтобы преодолеть это препятствие, исследователи начали разрабатывать диспергирующие агенты в качестве потенциальных терапевтических средств. Эти агенты нацелены на различные компоненты в биопленке EPS, ослабляя структуру и инициируя рассеивание бактерий, что теоретически может улучшить эффективность антибиотиков и иммунный клиренс. Чтобы определить эффективность диспергаторов при раневых инфекциях, мы разработали протоколы, которые измеряют рассеивание биопленки как ex vivo, так и in vivo. Мы используем модель хирургического иссечения мыши, которая была хорошо описана для создания хронических раневых инфекций, связанных с биопленкой. Чтобы контролировать рассеивание in vivo,мы заражаем раны бактериальными штаммами, которые экспрессируют люциферазу. Как только зрелые инфекции установлены, мы орошаем раны раствором, содержащим ферменты, которые разлагают компоненты биопленки EPS. Затем мы отслеживаем местоположение и интенсивность люминесцентного сигнала в ране и фильтрующих органах, чтобы предоставить информацию о достигнутом уровне рассеивания. Для анализа рассеивания биопленки ex vivo инфицированную раневую ткань погружают в раствор фермента, разлагающего биопленку, после чего оценивается бактериальная нагрузка, остающиеся в ткани, по сравнению с бактериальной нагрузкой в растворе. Оба протокола имеют сильные и слабые стороны и могут быть оптимизированы, чтобы помочь точно определить эффективность дисперсных методов лечения.

Introduction

Рост устойчивости к антибиотикам во всем мире приводит к отсутствию вариантов антибиотиков для лечения различных бактериальных инфекций¹. В дополнение к устойчивости к антибиотикам, бактерии могут получить толерантность к антибиотикам, приняв образ жизни, связанный с биопленкой^2. Биопленка представляет собой сообщество микроорганизмов, которые защищены матрицей полисахаридов, внеклеточной ДНК, липидов и белков^3,в совокупности называемых внеклеточным полимерным веществом (EPS). Поскольку кризис устойчивости к антибиотикам продолжается, крайне необходимы новые стратегии, которые продлевают использование антибиотиков или потенцируют эффективность. Антибиопленоополяторы являются одним из перспективных растворов^4.

Среди различных стратегий антибиопленки, которые были предложены, использование диспергаторов, которые нацелены на различные компоненты биопленки EPS, находятся на переднем крае терапевтической разработки^5. Гликозидгидролазы (ГР) являются одним из таких классов диспергаторов. GH представляют собой большой класс ферментов, которые катализируют расщепление различных связей внутри полисахаридов, которые обеспечивают структурную целостность EPS. Наша группа, как и другие, показала, что ГР может эффективно разлагать биопленки, индуцировать рассеивание и улучшать эффективность антибиотиков для ряда различных видов бактерий, как in vitro, так и in vivo^{6,7,8,9,10,11.}

С растущим интересом к рассеиванию биопленки важно разработать эффективные методы, которые оценивают эффективность рассеивания. Здесь мы представляем подробный протокол лечения биопленочно-ассоциированных раневых инфекций рассеивателем у мышей, а также оценку эффективности рассеивания in vivo и ex vivo. Общая цель состоит в том, чтобы обеспечить эффективные методы, которые могут быть использованы с доклиническими моделями для эффективного и действенного измерения рассеивания биопленки.

Модель хирургической иссеченной инфекции мышей была использована в этих исследованиях для установления инфекции, связанной с биопленкой. Мы использовали эту модель более 15 лет и опубликовали наши наблюдения широко^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21.} В целом, это модель нелетальной инфекции, где бактерии остаются локализованными в раневом ложе и связаны с биопленкой (бактерии, наблюдаемые в агрегатах, окруженных EPS), создавая хроническую инфекцию, которая длится до 3 недель. Однако, если у мышей ослаблен иммунитет (например, с диабетом 1 типа), они могут стать более восприимчивыми к развитию смертельной системной инфекции в этой модели.

В этом отчете мы предоставляем протоколы для оценки рассеивания бактерий из раны, как in vivo, так и ex vivo. Оба протокола могут быть использованы для изучения эффективности рассеивателя и имеют свои сильные и слабые стороны. Например, оценка рассеивания in vivo может предоставить важную информацию в режиме реального времени о распространении бактерий в другие части тела после рассеивания и о том, как реагирует хозяин. С другой стороны, оценка диспергирования ex vivo может быть более желательной для скрининга нескольких агентов, доз или составов, поскольку ткань может быть разделена на несколько секций, которые могут быть протестированы отдельно, тем самым уменьшая количество требуемых мышей. При оценке нескольких агентов мы обычно измеряем рассеивание сначала in vitro, как описано ^{ранее 6,9,22.} Затем мы тестируем наиболее эффективное тестирование ex vivo и резервное тестирование in vivo для ограниченного числа очень перспективных агентов.

Protocol

Этот протокол для животных был рассмотрен и одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Центром медицинских наук Техасского технического университета (протокол No 07044). Данное исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями Руководст…

Representative Results

В этом эксперименте 8-10-недельные самки швейцарских мышей Вебстера были инфицированы 104 КОЕ PAO1, несущих люминесцентную плазмиду pQF50-lux. Как описано выше, инфекцию разрешалось устанавливать в течение 48 ч до введения 3 х 30 мин обработки либо PBS (контроль транспортного средства), либо 10% …

Discussion

Здесь мы описываем протоколы, которые могут быть использованы для изучения эффективности агентов диспергирования биопленки. Эти протоколы могут быть легко адаптированы для использования с различными типами диспергирующих агентов, видами бактерий или образцами ex vivo, включая обр?…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment