تقييم تشتت بيو فيلم في جروح مورين
Summary
هنا، ونحن نصف السابقين في الجسم الحي وفي أساليب الجسم الحي لتقييم التشتت البكتيري من عدوى الجرح في الفئران. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لاختبار فعالية العلاجات الموضعية المضادة للميكروبات والأغشية الحيوية، أو لتقييم قدرة تشتت السلالات البكتيرية المختلفة أو الأنواع.
Abstract
وتورط العدوى ذات الصلة بيو فيلم في مجموعة واسعة من الحالات المزمنة مثل قرحة القدم السكري غير الشفاء، والتهاب الجيوب الأنفية المزمن، والتهاب الأذن الوسطى المتكرر، وغيرها الكثير. الخلايا الميكروبية داخل هذه العدوى محمية بمادة بوليمرية خارج الخلية (EPS) ، والتي يمكن أن تمنع المضادات الحيوية وتستضيف الخلايا المناعية من إزالة العدوى. للتغلب على هذه العقبة، بدأ المحققون في تطوير عوامل التشتت كعلاجات محتملة. تستهدف هذه العوامل مكونات مختلفة داخل EPS بيو فيلم، وإضعاف الهيكل، والشروع في تشتت البكتيريا، والتي يمكن نظريا تحسين فعالية المضادات الحيوية وإزالة المناعة. لتحديد فعالية عوامل التشتت لالتهابات الجروح ، قمنا بتطوير بروتوكولات تقيس تشتت بيو فيلم في الجسم الحي السابق وفي الجسم الحي. نحن نستخدم نموذج استئصال الماوس الجراحية التي تم وصفها بشكل جيد لخلق التهابات الجروح المزمنة المرتبطة بيو فيلم. لرصد التشتت في الجسم الحي، نصيب الجروح بسلالات بكتيرية تعبر عن لوسيفيراز. بمجرد أن تنشأ العدوى الناضجة ، نروي الجروح بمحلول يحتوي على إنزيمات تتحلل مكونات EPS بيو فيلم. ثم نراقب موقع وشدة الإشارة الإنارة في الجرح وتصفية الأعضاء لتوفير معلومات حول مستوى التشتت الذي تم تحقيقه. لتحليل الجسم الحي السابق لتشتت بيو فيلم ، يتم غمر أنسجة الجرح المصابة في محلول الإنزيم المهين للبيو فيلم ، وبعد ذلك يتم تقييم الحمل البكتيري المتبقي في الأنسجة ، مقابل الحمل البكتيري في المحلول. كلا البروتوكولين لديها نقاط القوة والضعف ويمكن تحسينها للمساعدة في تحديد بدقة فعالية العلاجات التشتت.
Introduction
ارتفاع مقاومة المضادات الحيوية في جميع أنحاء العالم يؤدي إلى عدم وجود خيارات المضادات الحيوية لعلاج مجموعة متنوعة من الالتهابات البكتيرية1. بالإضافة إلى مقاومة المضادات الحيوية، يمكن للبكتيريا الحصول على تحمل المضادات الحيوية من خلال اعتماد نمط الحياة المرتبطة بيو فيلم2. بيو فيلم هو مجتمع من الكائنات الحية الدقيقة التي تحميها مصفوفة من السكريات، الحمض النووي خارج الخلية، الدهون، والبروتينات3،تسمى مجتمعة مادة البوليمر خارج الخلية (EPS). ومع استمرار أزمة مقاومة المضادات الحيوية، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات جديدة تطيل أمد استخدام المضادات الحيوية أو تعمل على فعاليتها. عوامل مكافحة بيو فيلم هي واحدة واعدة الحل4.
من بين مختلف استراتيجيات مكافحة بيو فيلم التي تم اقتراحها، واستخدام عوامل التشتت، والتي تستهدف مكونات مختلفة من EPS بيو فيلم، هي في طليعة التنمية العلاجية5. الهدرلاسات الجليكوزيدية (GH) هي واحدة من هذه الفئة من عوامل التشتت. هرمون النمو هي فئة كبيرة من الانزيمات التي تحفز انشقاق الروابط المختلفة داخل السكريات التي توفر السلامة الهيكلية لEPS. وقد أظهرت مجموعتنا، فضلا عن غيرها، أن هرمون النمو يمكن أن تتحلل بشكل فعال الأغشية الحيوية، والحث على التشتت وتحسين فعالية المضادات الحيوية لعدد من الأنواع البكتيرية المختلفة، سواء في المختبر وفي الجسم الحي6،7،8،9،10،11.
مع تزايد الاهتمام في التشتت بيو فيلم، من المهم تطوير أساليب فعالة لتقييم فعالية التشتت. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لعلاج التهابات الجروح المرتبطة بيو فيلم مع عامل التشتت في الفئران، وتقييم فعالية التشتت، في الجسم الحي وفي الجسم الحي السابق. الهدف العام هو توفير أساليب فعالة يمكن استخدامها مع نماذج ما قبل السريرية لقياس تشتت بيو فيلم بفعالية وكفاءة.
تم استخدام نموذج عدوى استئصال مورين الجراحية في هذه الدراسات لإنشاء عدوى مرتبطة بيو فيلم. لقد استخدمنا هذا النموذج لأكثر من 15 عاما ونشرنا ملاحظاتنا على نطاق واسع7،9،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21. بشكل عام ، هذا هو نموذج العدوى غير المميتة حيث تظل البكتيريا مترجمة إلى سرير الجرح وترتبط بيو فيلم (البكتيريا التي ينظر إليها في المجاميع محاطة EPS) ، وإعداد عدوى مزمنة تستمر لمدة تصل إلى 3 أسابيع. ومع ذلك ، إذا كانت الفئران منقوصة المناعة (مع مرض السكري من النوع 1 على سبيل المثال) ، فإنها يمكن أن تصبح أكثر عرضة لتطوير عدوى جهازية قاتلة في هذا النموذج.
في هذا التقرير، نقدم بروتوكولات لتقييم تشتت البكتيريا من الجرح، سواء في الجسم الحي أو الجسم الحي السابق. يمكن استخدام كلا البروتوكولين لفحص فعالية عامل التشتت ويكون له نقاط قوته ونقاط ضعفه الخاصة. على سبيل المثال، يمكن لتقييم التشتت في الجسم الحي أن يوفر معلومات مهمة في الوقت الحقيقي حول انتشار البكتيريا إلى أجزاء أخرى من الجسم بعد التشتت، وكيفية استجابة المضيف. من ناحية أخرى ، قد يكون تقييم التشتت في الجسم الحي أكثر جاذبية لفحص عوامل أو جرعات أو تركيبات متعددة ، حيث يمكن تقسيم الأنسجة إلى أقسام متعددة يمكن اختبارها بشكل منفصل ، وبالتالي تقليل عدد الفئران المطلوبة. عند تقييم عوامل متعددة، ونحن عادة قياس التشتت أولا في المختبر كما هو موضح سابقا 6،9،22. ثم نقوم باختبار الجسم الحي السابق الأكثر فعالية والاحتياطي في اختبار الجسم الحي لعدد محدود من العوامل الواعدة للغاية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نحن وصف البروتوكولات التي يمكن استخدامها لدراسة فعالية عوامل التشتت بيو فيلم. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهولة لاستخدامها مع أنواع مختلفة من عوامل التشتت أو الأنواع البكتيرية أو عينات الجسم الحي السابق، بما في ذلك عينات الحطام السريري. يوفر هذا البروتوكول أيضا نموذجا مناسبا …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل منح من المعاهد الوطنية للصحة (R21 AI137462-01A1) ومؤسسة تيد ناش للحياة الطويلة ومؤسسة جاسبر ل. وجاك دينتون ويلسون ووزارة الدفاع (وزارة الدفاع W0318_19_NM_PP.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 14823434 | Use to complete serial dilutions of samples |
| 25G 58 in needle | Fisher | 14823434 | Attaches to 1 mL syringe |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture |
| Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used |
| Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | Use as pain mainagement- may use other options |
| Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used |
| Depilatory cream | Walmart | 287746 | Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair |
| Dressing Forceps, Serrated Tips | Fisher | 12-460-536 | Can use other forms of forceps |
| Erlenmeyer flasks baffled 125 mL | Fisher | 101406 | Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria |
| FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue |
| Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse |
| Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) | Fisher | 15340151 | Used to homogenize samples for plating |
| Isoflurane | Diamond Back Drugs | ||
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | Add 25 g/L and autoclave |
| Lidocaine 2% Injectable | Diamond Back Drugs | 2468 | Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting |
| Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment |
| Non-sterile cotton gauze sponges | Fisher | 13-761-52 | Use to remove the depilatory cream |
| PAO1 pQF50-lux bacterial strain | Ref [13] | N/A | PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results |
| Petri dishes | Fisher | PHR1772-500MG | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Fisher | BP3991 | Dilute 10x to 1x prior to use |
| Polyurethane dressing | Mckesson | 66024007 | Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections |
| Pseudomonas isolation agar | VWR | 90004-394 | Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes |
| Refresh P.M. | Walmart | Use on eyes to reduce dryness during procedure. | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher | 22-363-750 | Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area |
| Straight Delicate Scissors | Fisher | 89515 | Can also use curved scissors |
| Swiss Webster mice | Charles River | 551NCISWWEB | Other mice strains can be used |
| Syring Slip Tip 1 mL | Fisher | 14823434 | Used to administer drugs and enzyme treatment |
Referências
- Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
- Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
- Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
- Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
- Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
- Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
- Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
- Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. . Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
- Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
- Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
- Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
- Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
- Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
- Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
- Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).
- Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
- Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
- DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
- Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
- Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
- Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
- Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
- Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).
