뮤린 상처에서 생물막 분산 평가
Summary
여기에서, 우리는 마우스에 있는 상처 감염에서 세균성 분산을 평가하기 위한 ex vivo 및 생체 내 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 국소 항균 및 항 생물막 요법의 효능을 테스트하거나 다른 세균성 균주 또는 종의 분산 용량을 평가하는 데 활용 될 수 있습니다.
Abstract
생물막 관련 감염은 비 치유 당뇨병 발 궤양, 만성 부비동염, 재발성 중이염 미디어 등과 같은 다양한 만성 질환에 연루되어 있습니다. 이러한 감염 내의 미생물 세포는 항생제를 방지하고 면역 세포가 감염을 지우는 것을 방지할 수 있는 세포외 중합체 물질(EPS)에 의해 보호됩니다. 이 장애물을 극복하기 위하여는, 연구원은 잠재적인 치료로 분산 에이전트를 개발하기 시작했습니다. 이들 제제는 생물막 EPS 내의 다양한 성분을 표적으로 하여 구조를 약화시키고 박테리아의 분산을 시정하여 이론적으로 항생제 효능및 면역통전을 개선할 수 있다. 상처 감염에 대한 분산제의 효능을 결정하기 위해, 우리는 생체 내 생체 및 생체내 생물막 분산을 측정하는 프로토콜을 개발했습니다. 우리는 생물막 관련 만성 상처 감염을 만들기 위하여 잘 기술된 마우스 외과 절개 모형을 이용합니다. 생체 내분산을 모니터링하려면 루시파라제를 표현하는 세균균균으로 상처를 감염시킵니다. 일단 성숙한 감염이 설치되면, 우리는 생물막 EPS의 성분을 저하시키는 효소를 포함하는 용액으로 상처를 관개합니다. 그런 다음 상처 및 여과 기관의 발광 신호의 위치와 강도를 모니터링하여 달성된 분산 수준에 대한 정보를 제공합니다. 생물막 분산증의 전 생체 생체 분석의 경우, 감염된 상처 조직은 생체막 분해 효소 용액에 침수되며, 그 후 박테리아 부하가 조직에 남아 있는 용액의 세균 부하에 비해 평가된다. 두 프로토콜 모두 강점과 약점을 가지고 있으며 분산 치료의 효능을 정확하게 결정하는 데 최적화 될 수 있습니다.
Introduction
전 세계적으로 항생제 내성의 상승은 다양한 세균 감염을 치료하는 항생제 옵션의 부족으로 이어지고 있다1. 항생 저항 이외에, 박테리아는 생물막 관련 생활양식2를채택하여 항생 내성을 얻을 수 있습니다. 생물막은 다당류, 세포외 DNA, 지질 및 단백질3의매트릭스에 의해 보호되는 미생물의 공동체이며, 집단적으로 세포외 중합체 물질 (EPS)이라고 합니다. 항생 저항 위기가 계속됨에 따라 항생제의 사용을 연장하거나 항생제의 효능을 강력하게 하는 새로운 전략이 절실히 필요합니다. 바이오필름 방지 제는 하나의 유망한 솔루션4.
제안된 상이한 항생물막 전략 중, 생물막 EPS의 상이한 성분을 표적으로 하는 분산제의 활용은 치료개발5의최전선에 있다. 글리코사이드 하이드로라스(GH)는 분산제의 이러한 클래스 중 하나입니다. GH는 EPS에 구조적 무결성을 제공하는 다당류 내에서 다른 결합의 분열을 촉매하는 효소의 큰 클래스입니다. 우리 그룹은 다른 사람뿐만 아니라, GH가 효과적으로 생물막을 저하시키고, 분산을 유도하고, 생체 외와 생체 내6,7,8,9,10,11모두에서 다양한 세균성 종에 대한 항생제 효능을 향상시킬 수 있음을 보여주었습니다.
바이오필름 분산에 대한 관심이 증가함에 따라 분산 효능을 평가하는 효과적인 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 여기서, 우리는 생쥐의 분산제를 가진 생물막 관련 상처 감염의 치료를 위한 상세한 프로토콜을 제시하고, 분산 효능의 평가, 생체 내 및 전 생체 내. 전반적인 목표는 바이오필름 분산을 효과적이고 효율적으로 측정하기 위해 전임상 모델과 함께 사용할 수 있는 효과적인 방법을 제공하는 것입니다.
뮤린 외과 절제 감염 모형은 생물막 관련 감염을 설치하기 위하여 이 연구 결과에서 이용되었습니다. 우리는 15 년 이상이 모델을 사용하고 광범위하게 우리의관찰을 발표했다7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21. 일반적으로, 이것은 박테리아가 상처 침대에 국소남아 생물막 관련 (EPS에 둘러싸인 집계에서 본 박테리아) 최대 3 주 지속되는 만성 감염을 설정하는 비 치명적인 감염 모델입니다. 그러나, 마우스가 면역 타협하는 경우에 (타입-1 당뇨병과 같은), 그(것)들은 이 모형에 있는 치명적인 전신 감염을 개발하기에 더 취약해질 수 있습니다.
이 보고서에서, 우리는 상처에서 박테리아의 분산을 평가하기위한 프로토콜을 제공합니다, 모두 생체 내 및 전 생체. 두 프로토콜 모두 분산제의 효능을 검사하고 자신의 강점과 약점을 가지고 사용하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 생체 내에서 분산을 평가하면 분산 후 신체의 다른 부위에 박테리아가 퍼지는 것과 숙주가 어떻게 반응하는지에 대한 중요하고 실시간 정보를 제공할 수 있습니다. 한편, 분산전 생체내 를 평가하는 것은 조직이 별도로 테스트될 수 있는 여러 부분으로 나눌 수 있으므로, 따라서 요구되는 마우스의 수를 감소시키기 때문에 다중 제제, 투여량 또는 제형을 선별하는 것이 더 바람직할 수 있다. 여러 에이전트를 평가할 때, 당사는 일반적으로 이전에 설명된 6,9,22와같이 시험관 내 분산을 측정합니다. 그런 다음 가장 효과적인 ex vivo를 테스트하고 매우 유망한 에이전트의 제한된 수에 대한 생체 내 테스트를 예약합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 생물막 분산제의 효능을 연구하기 위해 활용할 수 있는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 임상 탈면 샘플을 포함하여 분산제, 세균성 종 또는 전 생체 샘플의 다른 유형으로 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 분산된 세균 세포를 수집하고 연구하기 위하여 임상적으로 관련있는 모형을 제공합니다. 분산된 세균 세포의 표현형은 판자 또는…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 보건원 (R21 AI137462-01A1), 테드 내쉬 롱 라이프 재단, 재스퍼 L. 및 잭 덴튼 윌슨 재단및 국방부 (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP)의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 14823434 | Use to complete serial dilutions of samples |
| 25G 58 in needle | Fisher | 14823434 | Attaches to 1 mL syringe |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture |
| Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used |
| Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | Use as pain mainagement- may use other options |
| Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used |
| Depilatory cream | Walmart | 287746 | Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair |
| Dressing Forceps, Serrated Tips | Fisher | 12-460-536 | Can use other forms of forceps |
| Erlenmeyer flasks baffled 125 mL | Fisher | 101406 | Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria |
| FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue |
| Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse |
| Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) | Fisher | 15340151 | Used to homogenize samples for plating |
| Isoflurane | Diamond Back Drugs | ||
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | Add 25 g/L and autoclave |
| Lidocaine 2% Injectable | Diamond Back Drugs | 2468 | Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting |
| Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment |
| Non-sterile cotton gauze sponges | Fisher | 13-761-52 | Use to remove the depilatory cream |
| PAO1 pQF50-lux bacterial strain | Ref [13] | N/A | PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results |
| Petri dishes | Fisher | PHR1772-500MG | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Fisher | BP3991 | Dilute 10x to 1x prior to use |
| Polyurethane dressing | Mckesson | 66024007 | Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections |
| Pseudomonas isolation agar | VWR | 90004-394 | Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes |
| Refresh P.M. | Walmart | Use on eyes to reduce dryness during procedure. | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher | 22-363-750 | Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area |
| Straight Delicate Scissors | Fisher | 89515 | Can also use curved scissors |
| Swiss Webster mice | Charles River | 551NCISWWEB | Other mice strains can be used |
| Syring Slip Tip 1 mL | Fisher | 14823434 | Used to administer drugs and enzyme treatment |
Referências
- Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
- Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
- Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
- Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
- Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
- Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
- Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
- Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. . Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
- Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
- Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
- Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
- Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
- Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
- Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
- Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).
- Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
- Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
- DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
- Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
- Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
- Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
- Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
- Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).
