Avaliação da dispersão de biofilme em feridas de Murine

Summary

Aqui, descrevemos métodos ex vivo e in vivo para avaliar a dispersão bacteriana de uma infecção por ferida em camundongos. Este protocolo pode ser utilizado para testar a eficácia de terapias antimicrobianas e anti-biofilme tópicas, ou para avaliar a capacidade de dispersão de diferentes cepas bacterianas ou espécies.

Abstract

As infecções relacionadas ao biofilm estão implicadas em uma ampla gama de condições crônicas, como úlceras diabéticas não curativas, sinusite crônica, otite média recorrente e muito mais. As células microbianas dentro dessas infecções são protegidas por uma substância polimérica extracelular (EPS), que pode impedir que antibióticos e células imunes hospedeiras limpem a infecção. Para superar esse obstáculo, os investigadores começaram a desenvolver agentes dispersos como potenciais terapêuticos. Esses agentes têm como alvo vários componentes dentro do EPS biofilme, enfraquecendo a estrutura e iniciando a dispersão das bactérias, o que pode teoricamente melhorar a potência dos antibióticos e o despejo imunológico. Para determinar a eficácia dos agentes de dispersão para infecções por feridas, desenvolvemos protocolos que medem a dispersão de biofilmes tanto ex vivo quanto in vivo. Usamos um modelo de excisão cirúrgica de camundongos que foi bem descrito para criar infecções de feridas crônicas associadas a biofilmes. Para monitorar a dispersão in vivo,infectamos as feridas com cepas bacterianas que expressam luciferase. Uma vez estabelecidas infecções maduras, irrigamos as feridas com uma solução contendo enzimas que degradam componentes do EPS biofilme. Em seguida, monitoramos a localização e intensidade do sinal luminescente na ferida e órgãos filtrantes para fornecer informações sobre o nível de dispersão alcançado. Para análise ex vivo da dispersão de biofilmes, o tecido da ferida infectada está submerso em solução enzimética degradante de biofilme, após a qual a carga bacteriana restante no tecido, versus a carga bacteriana em solução, é avaliada. Ambos os protocolos têm pontos fortes e fracos e podem ser otimizados para ajudar a determinar com precisão a eficácia dos tratamentos de dispersão.

Introduction

O aumento da resistência a antibióticos em todo o mundo está levando à falta de opções de antibióticos para tratar uma variedade de infecções bacterianas¹. Além da resistência a antibióticos, as bactérias podem ganhar tolerância a antibióticos adotando um estilo de vida associado ao biofilme². Um biofilme é uma comunidade de microrganismos que são protegidos por uma matriz de polissacarídeos, DNA extracelular, lipídios e proteínas³, coletivamente chamada de substância polimérica extracelular (EPS). À medida que a crise de resistência a antibióticos continua, novas estratégias que prolongam o uso ou potencializam a eficácia de antibióticos são extremamente necessárias. Os agentes anti-biofilme são uma solução promissora⁴.

Entre as diferentes estratégias anti-biofilmes que foram propostas, a utilização de agentes dispersos, que visam diferentes componentes do EPS biofilme, estão na vanguarda do desenvolvimento terapêutico⁵. As hidrolases glicóvias (GH) são uma dessas classes de agente disperso. GH são uma grande classe de enzimas que catalisam o decote de diferentes laços dentro dos polissacarídeos que fornecem integridade estrutural ao EPS. Nosso grupo, assim como outros, têm demonstrado que o GH pode efetivamente degradar biofilmes, induzir dispersão e melhorar a eficácia de antibióticos para uma série de espécies bacterianas diferentes, tanto in vitro quanto in vivo^{6,7,8,9,10,11}.

Com um crescente interesse pela dispersão de biofilmes, é importante desenvolver métodos eficazes que avaliem a eficácia dispersa. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o tratamento de infecções de feridas associadas a biofilmes com um agente dispersivo em camundongos, e a avaliação da eficácia dispersão, in vivo e ex vivo. O objetivo geral é fornecer métodos eficazes que possam ser usados com modelos pré-clínicos para medir a dispersão de biofilmes de forma eficaz e eficiente.

Um modelo de infecção por excisão cirúrgica de murina foi utilizado nesses estudos para estabelecer uma infecção associada a biofilmes. Utilizamos esse modelo há mais de 15 anos e publicamos nossas observações extensivamente^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. Em geral, este é um modelo de infecção não letal onde as bactérias permanecem localizadas no leito da ferida e são associadas ao biofilme (bactérias vistas em agregados cercados por EPS), configurando uma infecção crônica que dura até 3 semanas. No entanto, se os camundongos são imunocomprometidos (com diabetes tipo 1, por exemplo), eles podem se tornar mais suscetíveis ao desenvolvimento de uma infecção sistêmica fatal neste modelo.

Neste relatório, fornecemos protocolos para avaliar a dispersão de bactérias de uma ferida, tanto in vivo quanto ex vivo. Ambos os protocolos podem ser usados para examinar a eficácia de um agente disperso e ter suas próprias forças e fraquezas. Por exemplo, avaliar a dispersão in vivo pode fornecer informações importantes e em tempo real sobre a disseminação de bactérias para outras partes do corpo após a dispersão, e como o host responde. Por outro lado, avaliar a dispersão ex vivo pode ser mais desejável para a triagem de múltiplos agentes, doses ou formulações, pois o tecido pode ser dividido em múltiplas seções que podem ser testadas separadamente, reduzindo assim o número de camundongos necessários. Ao avaliar vários agentes, normalmente medimos a dispersão primeiro in vitro como descrito anteriormente ^6,9,22. Testamos então o teste ex vivo e reserva mais eficaz para um número limitado de agentes muito promissores.

Protocol

Este protocolo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Texas Tech University Health Sciences Center (protocolo número 07044). Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. 1. Preparação de bactérias para infecções de camundongos NOTA: Aqui descrevemos ratos infectantes apenas com Pseudomonas aeru…

Representative Results

Neste experimento, camundongos webster suíços de 8 a 10 semanas foram infectados com 104 UFC de PAO1 carregando a luminescence plasmid pQF50-lux. Como descrito acima, foi permitida uma infecção estabelecer-se por 48 horas antes de administrar tratamentos de 3 x 30 min de PBS (controle de veículo) ou 10% GH (tratamento) para digerir o EPS biofilme. Os camundongos foram retratados antes do tratamento, logo após o tratamento (0h) e às 10h e 20h após o tratamento. Figura 2A e<…

Discussion

Aqui descrevemos protocolos que podem ser utilizados para estudar a eficácia dos agentes de dispersão de biofilmes. Esses protocolos podem ser facilmente adaptados para uso com diferentes tipos de agentes dispersivos, espécies bacterianas ou amostras ex vivo, incluindo amostras de debridamento clínico. Este protocolo também fornece um modelo clinicamente relevante para coletar e estudar células bacterianas dispersas. Os fenótipos de células bacterianas dispersas têm se mostrado distintos dos das célula…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment