Condensados de proteínas inducidas por dimerización química en telómeros
Summary
Este protocolo ilustra un sistema de dimerización de proteínas inducido químicamente para crear condensados en la cromatina. Se demuestra la formación del cuerpo nuclear de la leucemia promielocítica (LMP) en telómeros con dimerizadores químicos. El crecimiento, la disolución, la localización y la composición de las gotas se controlan con imágenes de células vivas, inmunofluorescencia (IF) e hibridación fluorescente in situ (FISH).
Abstract
Los condensados asociados a la cromatina están implicados en muchos procesos nucleares, pero los mecanismos subyacentes siguen siendo difíciles de alcanzar. Este protocolo describe un sistema de dimerización de proteínas inducido químicamente para crear condensados en los telómeros. El dimerizador químico consiste en dos ligandos unidos que pueden unirse a una proteína: Halo ligando a Halo-enzima y trimetoprima (TMP) a E. coli dihidrofolato reductasa (eDHFR), respectivamente. La fusión de la enzima Halo a una proteína telómero ancla los dimerizantes a los telómeros a través de la unión covalente ligando-enzima de Halo. La unión de TMP a eDHFR recluta proteínas de separación de fase fusionadas con eDHFR a telómeros e induce la formación de condensado. Debido a que la interacción TMP-eDHFR no es covalente, la condensación se puede revertir mediante el uso de exceso de TMP libre para competir con el dimerizador para la unión de eDHFR. Se muestra un ejemplo de inducción de la formación de cuerpos nucleares de leucemia promielocítica (LMP) en los telómeros y determinación del crecimiento, disolución, localización y composición del condensado. Este método se puede adaptar fácilmente para inducir condensados en otras ubicaciones genómicas fusionando Halo a una proteína que se une directamente a la cromatina local o a dCas9 que está dirigida al locus genómico con un ARN guía. Al ofrecer la resolución temporal requerida para la obtención de imágenes en vivo de una sola célula mientras se mantiene la separación de fases en una población de células para ensayos bioquímicos, este método es adecuado para sondear tanto la formación como la función de los condensados asociados a la cromatina.
Introduction
Muchas proteínas y ácidos nucleicos se someten a separación de fase líquido-líquido (LLPS) y se autoensamblan en condensados biomoleculares para organizar la bioquímica en las células1,2. LLPS de proteínas de unión a cromatina conduce a la formación de condensados que están asociados con loci genómicos específicos y están implicados en varias funciones locales de cromatina3. Por ejemplo, LLPS de la proteína HP1 subyace a la formación de dominios de heterocromatina para organizar el genoma4,5,LLPS de factores de transcripción forma centros de transcripción para regular la transcripción6,LLPS de mRNAs nacientes y peines multi-sexo la proteína genera cuerpos de locus histonas para regular la transcripción y procesamiento de mRNAs de histonas7. Sin embargo, a pesar de que se han descubierto muchos ejemplos de condensados asociados a la cromatina, los mecanismos subyacentes de formación, regulación y función del condensado siguen siendo poco conocidos. En particular, no todos los condensados asociados a la cromatina se forman a través de LLPS y aún se necesitan evaluaciones cuidadosas de la formación de condensado en células vivas8,9. Por ejemplo, se ha demostrado que la proteína HP1 en ratones tiene solo una capacidad débil para formar gotas líquidas en células vivas y los focos de heterocromatina se comportan como glóbulos de polímero colapsado10. Por lo tanto, las herramientas para inducir condensados de novo en la cromatina en las células vivas son deseables, particularmente aquellas que permiten el uso de imágenes en vivo y ensayos bioquímicos para monitorear la cinética de la formación de condensados, las propiedades físicas y químicas de los condensados resultantes y las consecuencias celulares de la formación de condensados.
Este protocolo reporta un sistema de dimerización química para inducir condensados de proteínas en la cromatina11 (Figura 1A). El dimerizador consiste en dos ligandos vinculados que interactúan con proteínas: trimetoprima (TMP) y ligando Halo y puede dimerizar proteínas fusionadas a los receptores cognados: Escherichia coli dihidrofolato reductasa (eDHFR) y una enzima alquilldehalogenasa bacteriana (enzima Halo), respectivamente12. La interacción entre el ligando Halo y la enzima Halo es covalente, lo que permite que la enzima Halo se use como ancla fusionándola con una proteína de unión a la cromatina para reclutar una proteína de separación de fase fusionada con eDHFR a cromatina. Después del reclutamiento inicial, el aumento de la concentración local de la proteína que separa la fase pasa la concentración crítica necesaria para la separación de fases y, por lo tanto, nuclea un condensado en el anclaje (Figura 1B). Al fusionar proteínas fluorescentes (por ejemplo, mCherry y eGFP) a eDHFR y Halo, la nucleación y el crecimiento de condensados se pueden visualizar en tiempo real con microscopía de fluorescencia. Debido a que la interacción entre eDHFR y TMP no es covalente, se puede agregar un exceso de TMP libre para competir con el dimerizador por la unión de eDHFR. Esto liberará la proteína de separación de fase del anclaje y disolverá el condensado asociado a la cromatina.
Utilizamos esta herramienta para inducir la formación de cuerpo nuclear de leucemia promielocítica (LMP) de novo en telómeros en células cancerosas negativas para telomerasa que utilizan una vía alternativa de alargamiento de telómeros (ALT) para el mantenimiento de los telómeros13,14. Los cuerpos nucleares PML son compartimentos sin membrana involucrados en muchos procesos nucleares15,16 y se localizan de manera única en los telómeros ALT para formar AB, para los cuerpos PML asociados a los telómeros ALT17,18. Los telómeros se agrupan dentro de los AB, presumiblemente para proporcionar plantillas de reparación para la síntesis de ADN de telómeros dirigidos por homología en ALT19. De hecho, se ha detectado la síntesis de ADN de telómeros en AB y los AB juegan un papel esencial en el enriquecimiento de los factores de reparación del ADN en los telómeros20,21. Sin embargo, se desconocieron los mecanismos subyacentes al ensamblaje de APB y la agrupación de telómeros dentro de los AB. Dado que las proteínas de los telómeros en las células ALT se modifican de forma única mediante un pequeño modificador similar a la ubiquitina (SUMO)22,muchos componentes de APB contienen sitios de sumoilación 22,23, 24,25 y / o motivos que interactúan con SUMO (SIM)26,27 y las interacciones SUMO-SIM impulsan la separación de fases28, planteamos la hipótesis de que la sumoilación en los telómeros conduce al enriquecimiento de proteínas que contienen SUMO / SIM y Las interacciones SUMO-SIM entre esas proteínas conducen a la separación de fases. La proteína PML, que tiene tres sitios de sumoilación y un sitio SIM, se puede reclutar a telómeros sumoilados para formar AB y la coalescencia de AB líquidos conduce a la agrupación de telómeros. Para probar esta hipótesis, utilizamos el sistema de dimerización química para imitar la formación de APB inducida por la sumoilación mediante el reclutamiento de SIM a telómeros (Figura 2A)11. GFP se fusiona con Haloenzyme para visualización y con la proteína de unión a telómeros TRF1 para anclar el dimerizador a los telómeros. SIM se fusiona con eDHFR y mCherry. La cinética de la formación de condensados y la agrupación de telómeros inducida por la fusión de gotas se siguen con imágenes de células vivas. La separación de fases se invierte añadiendo un exceso de TMP libre para competir con la unión eDHFR. La inmunofluorescencia (IF) y la hibridación fluorescente in situ (FISH) se utilizan para determinar la composición del condensado y la asociación telomérica. Recruiting SIM enriquece suMO en telómeros y los condensados inducidos contienen PML y por lo tanto son APBs. El reclutamiento de un mutante SIM que no puede interactuar con SUMO no enriquece SUMO en telómeros ni induce la separación de fases, lo que indica que la fuerza impulsora fundamental para la condensación de APB es la interacción SUMO-SIM. De acuerdo con esta observación, los polímeros poliSUMO-polySIM que se fusionan a un factor de unión TRF2 RAP1 también pueden inducir la formación de APB29. En comparación con el sistema de fusión polySUMO-polySIM donde la separación de fases ocurre siempre que se produzcan suficientes proteínas, el enfoque de dimerización química presentado aquí induce la separación de fases bajo demanda y, por lo tanto, ofrece una mejor resolución temporal para monitorear la cinética de la separación de fases y el proceso de agrupamiento de telómeros. Además, este sistema de dimerización química permite el reclutamiento de otras proteínas para evaluar su capacidad para inducir la separación de fases y la agrupación de telómeros. Por ejemplo, una proteína desordenada reclutada a los telómeros también puede formar gotas y telómeros de racimo sin inducir la formación de APB, lo que sugiere que la agrupación de telómeros es independiente de la química de APB y solo se basa en la propiedad líquida de APB11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo demostró la formación y disolución de condensados en telómeros con un sistema de dimerización química. La cinética de la separación de fases y la agrupación de telómeros inducida por la fusión de gotas se monitorean con imágenes en vivo. La localización y composición del condensado se determinan con ADN FISH y proteína IF.
Hay dos pasos críticos en este protocolo. El primero es determinar la concentración de proteínas y dimerizantes. El éxito en la inducción …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (1K22CA23763201 a H.Z., GM118510 a D.M.C.) y la fundación Charles E. Kaufman a H.Z. Los autores desean agradecer a Jason Tones por revisar el manuscrito.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
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