세포 및 약물 전달 응용 을 위한 주사용 수급 분자 고분자 고분자 나노 입자 하이드로겔

Summary

이 프로토콜은 주사용, 초분자 폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔 생체 재료의 합성 및 제형을 설명합니다. 약물 전달, 바이오 의약품 안정화 및 세포 캡슐화 및 납품을 위한 이러한 물질의 적용이 입증된다.

Abstract

이러한 방법은 생체 재료로 사용하기 위해 주사용, 초분자 폴리머 나노 입자 (PNP) 하이드로겔을 공식화하는 방법을 설명합니다. PNP 하이드로겔은 동적, 다원적 상호 작용을 통해 비 공유 크로스 링커 역할을 하는 네트워크 폴리머및 자체 조립 코어 쉘 나노 입자로서 소수성 변형 셀룰로오스의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. 이러한 방법은 나노 침전을 통해 이러한 자체 조립 나노 입자의 형성뿐만 아니라 튜닝 가능한 기계적 특성으로 하이드로겔을 형성하기 위해 두 성분의 제형 및 혼합을 모두 설명합니다. 합성된 재료의 품질을 특성화하기 위해 다이나믹 광 산란(DLS) 및 유경학의 사용도 상세하다. 마지막으로, 약물 전달, 바이오 의약품 안정화 및 세포 캡슐화 및 전달을 위한 이러한 하이드로겔의 유용성은 약물 방출, 열 안정성 및 세포 정착 및 생존가능성을 특성화하기 위해 체외 실험을 통해 입증된다. 생체 적합성, 주사용 성 및 가벼운 젤 형성 조건으로 인해 이 하이드로겔 시스템은 다양한 생체 의학 응용 분야에 적합한 쉽게 튜닝할 수 있는 플랫폼입니다.

Introduction

주사용 하이드로겔은 치료 세포와 약물을 대조된 방식으로 신체에 전달하는 새로운^{도구이다.} 이러한 물질은 약물 이나 세포로 로드될 수 있으며 피상 조직에 직접 주입을 통해 또는 깊은 조직에 카테터 전달에 의해 최소 침습적 방식으로 투여 될 수있다. 일반적으로 주사용 하이드로겔은 일시적인 물리적 상호 작용에 의해 서로 연결되는 수분 부은 폴리머 네트워크로 구성됩니다. 나머지에서, 이러한 크로스 링크는 젤에 고체와 같은 구조를 제공하지만, 충분한 기계적 힘의 적용시 이러한 크로스 링크는 일시적으로 중단되어 물질을 쉽게^2를흐를 수있는 액체와 같은 상태로 변환합니다. 이러한 유변학적 특성으로, 물루³시 작은 바늘 직경을 통해 물리적 하이드로겔이 얇게 전단되고 흐르는 것을 허용하는 것은 이러한 유변학적 특성이다. 주입 후, 재료 개혁의 중합체 네트워크는 자체 치유를 허용하고 신속하게 시투^4,5에서고체와 같은 젤을 형성할 수 있게 한다. 이러한 구조는 조직^재생6,7을위한 약물 또는 비계에 대한 느린 방출 창고역할을 할 수 있다. 이들 물질은 약물 전달 기술,재생 의학 및 면역공학^{1,8,9,10,11,12를}포괄하는 다양한 응용 분야에서 사용되어 왔다.

천연 소재(예를 들어, 알기네이트 및 콜라겐) 및 합성 물질(예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 또는 이와 유사한 수성 중합체)는 생체 적합성 주사용 하이드로겔^{물질(13,14,15)으로}개발되었다. 많은 천연 소재는 재현성^4,16에영향을 미치는 배치 대 배치 변동을 나타낸다. 이러한 물질은 종종 온도에 민감한, 생리 온도에 도달 하 고 치료; 따라서 이러한 자료를 처리하는 것은 추가적인 기술적 및 물류 적 과제를^{야기한다(17)}. 합성 물질은 보다 정밀한 화학적 제어와 우수한 재현성을 허용하지만, 이러한 물질은 때때로 생체 적합성을 제한하는 불리한 면역 반응의 대상이 될 수 있으며, 생체 내 치료 응용 분야에서 중요한^{특징인 생체}내 치료 응용^6,18,19. 최근 연구에 따르면 기계적 특성 최적화, 폴리머 네트워크 메쉬 크기, 생리활성 분자 큐, 생분해성 및 물질의 면역원성을 포함한 주사용 하이드로겔 소재엔지니어링에 관여하는 많은 복잡한 설계 기준이 있는 것으로 나타났다(^{20,21,22,23,24,25, 26).} 이러한 모든 요소는 관심의 적용에 따라 고려해야 하며, 이는 모듈식 화학적 튜닝 가능한 플랫폼이 광범위한 응용 프로그램을 만족시키는 데 이상적입니다.

본 방법은 튜닝 가능한 기계적 특성, 높은 생체 적합성 및 낮은 면역원성을 나타내는 주사용 폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔 플랫폼의 제형 및 사용을 설명하고, 생리활성 분자 큐^{27,28,29,30,31,32,33을}결합하기 위한 부위를 제시한다. 이러한 PNP 수압겔은 수성 변형 셀룰로오스 폴리머및 폴리(에틸렌 글리콜)-블록 폴리(lacticacid) (PEG-PLA) (PEG-PLA)^{(27) 27,34로} 구성된 자체 조립 코어 쉘 나노입자로 구성되어 있어 수분자 네트워크를 생성한다. 보다 구체적으로, 도데킬-변형 된 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스 폴리머(HPMC-C_12)는이러한 나노입자 사이의 PEG-PLA 나노입자 및 교량의 표면과 동적으로 상호 작용하여 이 중합체^{네트워크(27,34)를}형성한다. 이러한 동적, 다원 상호 작용을 통해 재료는 주입 중에 얇은 전단을 하고 투여 후 빠르게 자가 치유할 수 있습니다. PNP 하이드로겔 성분은 간단한 1냄비 반응을 통해 쉽게 제조되고 PNP 하이드로겔은 두^{성분(35)의}간단한 혼합에 의해 온화한 조건하에서 형성된다. 제조의 용이성으로 인해 이 하이드로겔 플랫폼은 스케일에서 매우 확장성이 높습니다. PNP 하이드로겔의 기계적 특성 및 메쉬 크기는 제형에서 폴리머 및 나노입자 성분의 중량 퍼센트를 변경하여 제어됩니다. 이 플랫폼을 가진 사전 연구는 PNP 하이드로겔이 생체 적합성이 높고 생분해성 및 비면역원성^{28,30,31임을}나타낸다. 전반적으로, 이 하이드로겔은 수술 후 접착 방지, 조직 공학 및 재생, 지속적인 약물 전달 및 면역 공학을 포괄하는 생물 의학 응용 분야에서 광범위한 유틸리티를 제시합니다.

Protocol

이 프로토콜을 시작하기 전에 이전에 게시된 방법(27,28, 29, 30,31,36,37, 37,38)을사용하여 HPMC-C12 및 PEG-PLA를 합성할 필요가있다. 1. 나노 입자 (NP) 나노 침전에 의한 합성 참고: 이 섹션에서는 완충액에서 20wt% NP의 250μL을 생산하는 단일 일괄 처리(배치당 50mg의 건식 PEG-PLA 폴리머)를 생성하는 단일 일괄 처리의 합성을 설명합니다. 일괄 처리 수를 확장하기 위한 메모는 관련 단계에서 제공됩니다. PEG-PLA 폴리머 50 mg을 8mL 유리 신경병 바이알로 측정하고 아세토나이트 1mL를 추가합니다. 소용돌이가 완전히 녹습니다.참고: 일괄 처리 수를 확장하려면 이 단계를 선형으로 확장하고 단일 유리병에 필요한 총 양의 폴리머 및 용매를 추가합니다. 작은 교반 바가 있는 20mL 유리 반짝임 바이알에 10mL의 초순수물을 넣습니다. 600 rpm으로 설정된 교반 판에 놓습니다.참고: 1.1단계가 확장된 경우에도 각 상응하는 배치에 대해 개별 신경병 바이알이 침전될 필요가 있습니다. 예를 들어, 아세토닐릴4mL에 용해된 폴리머 200 mg의 경우 4 x 20mL 신자극을 준비한다. 나노 침전물에 의해 NPs를 형성하려면 200 μL 파이펫을 사용하여 물 속으로 드롭 와이즈 폴리머 용매 용액 1 mL을 추가합니다. 2분 간 저어주세요. PEG-PLA의 PLA 블록은 물에 용해되지 않으며, 그 결과 코어 쉘 NP는 소수성 PLA 블록과 함께 코어로 자체 조립하고 소수성 PEG 블록은 쉘로 자조립합니다. 동적 광 산란(DLS)을 통해 파티클 크기를 확인합니다.참고: 이 절차는 관련 소프트웨어 패키지가 있는 상용 플레이트 판독기를 위해 특별히 작성되었습니다(재료 표참조). 대체 계측기를 사용하려면 계측기 제조업체에서 설명한 샘플 준비 방법을 참조하십시오. 초순수 80μL로 NP 용액20μL을 희석시(분석 농도: 1 mg/mL PEG-PLA NP). 투명 하부 블랙 384웰 플레이트에 잘 30 μL을 추가합니다(삼중판으로 분석). 소프트웨어 패키지의 사전 설정 프로토콜 옵션을 사용하여 DLS 플레이트 판독기에서 각 샘플의 유체 역학 반경 및 다분산성을 측정합니다. 일반적인 프로토콜의 예로, 데이터 수집 매개 변수를 설정하여 수집당 2-5s 지속 시간의 5-10 DLS 측정을 획득한 다음 구형 단백질 모델에서 계산된 평균 입자 크기 및 분포를 음량으로 보고합니다. 일관된 유변학적 특성을 가진 하이드로겔을 형성하려면, 생성된 입자는 0.2의 다분산성(PD)< 유체역학 직경의 30-50 nm이어야 한다.참고: NP가 원하는 것보다 작은 경우, 1단계에서 75% 아세토니톨/25% 디메틸 설산화물(DMSO)의 용액을 사용한다. 용매 용액에서 DMSO의 비율을 늘리면 일반적으로 입자 크기가 증가합니다. NP 용액을 20mL 신경화 바이알에서 원심 필터 장치로 전송합니다. 1h4500 x g의 원심분리기는 NP 용액을 <250 μL로 농축한다. 인산염 완충식식염수(PBS)와 같은 원하는 완충제에서 재연하여 20wt% NPs. 파이펫은 원심 필터 유닛의 내용물들을 고지된 미세원심분리기 튜브 또는 유리 신자극 바이알로 질량 균형에 유동한다. 소량(50-100 μL)의 버퍼를 사용하여 필터를 헹구고 모든 NPs의 수집을 보장합니다. 버퍼를 추가하여 총 질량 250 mg에 도달합니다.참고: 재서스펜션 중에 일괄 처리를 풀수 있습니다. NP 스톡 솔루션은 약 1개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다. 동결하지 마십시오. 더 긴 저장소의 경우 사용하기 전에 DLS에서 크기와 다분산성을 확인합니다. 2. 하이드로겔 제제 및 약물 또는 세포의 캡슐화 참고: 이 섹션에서는 2:10 PNP 하이드로겔 제형의 1mL의 제조를 설명하며, 2:10은 2wt% HPMC-C 12 및 10wt% PP(총 고체 폴리머12개) 및 88wt% 완충액, 약물 화물 용액 또는 셀 서스펜션을 나타낸다. 제형 백분율은 다양한 기계적 특성을 가진 하이드로겔을 산출하도록 다양할 수 있다. 예를 들어, 1:5 PNP 하이드로겔은 표시된 세포 침전 및 생존 성 실험 결과에 사용되었다. PBS(또는 기타 완충제)에서 6wt% HPMC-C12의 재고 솔루션을 준비합니다. 48h용으로 용해하여 폴리머가 완전히 분산되도록 합니다.참고: HPMC-C12 재고 솔루션은 실온에서 수개월 동안 안정적입니다. 그러나, 4°C에서 의 저장은 미생물 성장을 억제하는 것이 좋습니다. 추가 333 6 wt% HPMC-C12 재고 용액에 1 mL Luer 잠금 주사기에 추가 합니다. 마이크로센심심분리기 튜브에 20wt% NP 스톡 솔루션500 μL을 추가합니다. 혼합PBS와 파이펫의 167 μL을 추가합니다. 바늘을 사용하여, 희석 된 NP 용액으로 또 다른 1 mL 루어 잠금 주사기를 채웁니다.참고: 약물 화물을 적재하기 위해 하이드로겔에서 약물의 원하는 최종 농도를 계산하고 적절한 양을 NP와 혼합된 PBS의 167 μL에 적재한다. 약물 안정성을 모니터링하기 위해 시투 분석에 분자 프로브가 필요한 경우, 약물 화물을 적재하기 위해 상술한 바와 유사한 방식으로 프로브를 적재한다. 셀을 로드하려면 하이드로겔에서 원하는 최종 세포 농도를 계산하고 적절한 수의 세포를 NP와 혼합되는 PBS의 167 μL에 로드한다. 팔꿈치 혼합법(35)을사용하여 두 개의 하이드로겔 성분(HPMC-C12 및 NPs)을 혼합한다. NP 용액을 포함하는 주사기에 Luer 팔꿈치 커넥터를 부착합니다(선택적으로 약물 화물 또는 셀을 포함). 반월 상 연골이 열린 끝에 보일 때까지 팔꿈치를 통해 NP 솔루션을 밀어 넣습니다. 약간 뒤로 당겨 HPMC-C12 솔루션이 포함된 주사기를 연결합니다.참고: 혼합 과정에서 하이드로겔 전체의 기포의 형성과 분산을 방지하기 위해 팔꿈치 연결의 공기를 최소화하는 것이 중요합니다. 팔꿈치 믹서와 세포를 혼합 할 때, 너무 빨리 혼합이 높은 전단 힘에 세포를 적용 할 수 있기 때문에 더 부드럽게 혼합주의, 세포 죽음으로 이어지는. 균일하고 불투명한 백색 하이드로겔 소재가 형성될 때까지 약 60사이클 동안 팔꿈치 믹서를 통해 두 개의 용액을 앞뒤로 펌핑한다. 하이드로겔의 전체 부피를 하나의 주사기로 밀어 넣습니다. 빈 주사기를 제거하고 플런저를 젤로 적재된 주사기에 다시 그려 팔꿈치 커넥터에서 재료를 회수합니다. 바늘이나 플러그가 있는 캡.참고: 혼합 과정에서 의한 데드 스페이스로 인해 손실된 하이드로겔 부피의 ~300 μL을 차지할 필요가 있다. 예를 들어 최종 하이드로겔 부피의 700 μL이 원하는 경우 1mL의 하이드로겔을 준비해야 합니다. 하이드로겔 제형 공정은 더 큰 주사기를 사용하여 확장될 수 있다. 그러나, 2:10과 같은 뻣뻣한 하이드로겔 제형의 경우, 주사기 배럴의 증가비율로 인해 3mL 이상의 주사기로부터 팔꿈치 또는 바늘 직경의 증가비율로 인해 주사기로부터 혼합 및 주입하기가 어려워질 수 있다. 실온에서 주사기에 하이드로겔을 보관하십시오. 그러나 약물이 캡슐화되는 경우 약물 제조업체가 달리 지정하지 않는 한 4 °C에서 보관하는 것이 좋습니다. 재료를 동결하지 마십시오. 3. 하이드로겔 제형의 유변학적 특성 측정 참고: 이 프로토콜은 20mm 톱니 모양의 플레이트 형상이 있는 재료 표에 언급된 상용 레오미터와 함께 특별히 사용됩니다. 다른 계측기를 사용하려면 샘플 준비를 위한 제조업체의 지침을 참조하십시오. 유변학적 특성화를 위해 PNP 하이드로겔의 최소 700 μL을 공식화합니다. 톱니 모양의 레오미터 플레이트 의 중앙에 재료를 주입합니다. 양은 선택한 형상 간격에 따라 달라집니다. 참고로, 700 μm 간격은 ~400-500 μL의 재료가 필요합니다. 레오미터를 트림 갭(500-1000 μm)으로 낮추고 PNP 하이드로겔과 접촉하여 균일하고 완전히 채워지도록 상단 레오미터 플레이트를 천천히 돌립니다. PNP 하이드로겔의 하중을 검사하여 전체 레오미터 플레이트 표면을 덮습니다. 주걱 또는 플라스틱 트리머를 사용하여 접시에서 약간 부풀어 오르는 과도한 재료를 부드럽게 손질하고 제거하십시오. 계측기를 최종 형상 간격으로 낮추고 샘플이 깔끔하게 로드되었는지 확인합니다. 진폭 이나 주파수 스윕, 또는 흐름 스윕 또는 단계 테스트와 같은 흐름 테스트를 사용 하 여 샘플의 기계적 특성을 측정 합니다.참고: 표시된 대표 데이터에서 진동 진폭 테스트는 10 개의 rad /s의 일정한 주파수에서 실행됩니다. 진동 주파수 스윕은 진폭 스윕의 선형 점탄성 정권 내에서 일정한 1% 스트레인으로 실행됩니다. 흐름 스윕은 높은 전단 속도에서 낮은 전단 속도(39)로실행되었습니다. 모든 테스트는 수집된 데이터 10년당 10포인트와 실온으로 완료됩니다. 시험 파라미터는 제형의 특성에 따라 조정될 필요가 있을 수 있다. 2:10 제형과 같은 경직된 PNP 물질을 높은 전단 속도로 가중시켜 물질이 레오미터 플레이트에서 배출되어 부정확한 기계적 특성화를 초래하고 후속 테스트 사이에 시료를 재장전해야 합니다. 아래 표시된 대표적인 데이터는 품질 관리 테스트 중에 비교에 사용할 수 있습니다. 4. 체외 약물 방출 특성화 유리 모세관 튜브를 원하는 길이로 절단하여 모세관 튜브를 준비합니다. 일회용 주걱 또는 파이펫 팁을 사용하여 각 튜브의 한쪽 끝을 밀봉하여 소량의 에폭시를 튜브 끝으로 밀어 플러그를 형성합니다. 에폭시가 제조업체의 권장 시간당 설정되도록 허용합니다.참고: 튜브는 주사 바늘의 길이보다 짧아야 합니다. 2-3 μm 내경을 가진 튜브는 2.5인치의 길이가 총 부피의 최소 300 μL을 포함하는 것이 좋습니다. 관심 있는 약물을 함유하는 주사기에 PNP 하이드로겔 물질의 최소 500 μL을 제조한다. 각 샘플 그룹을 별도의 주사기로 준비합니다. 긴 피하 바늘(22G, 4인치)을 사용하여 각 모세혈관의 바닥에 PNP 하이드로겔의 100-200 μL을 주입한다. 샘플 그룹당 적어도 3개의 튜브(triplicate)를 준비합니다. (선택 사항) 하이드로겔 표면이 균일하도록 1000 x g에서 원심분리기와 원심분리기에 채워진 모세관 튜브를 1분 간 배치합니다. 이 단계는 재료의 표면을 부드럽게하기 위해 필요에 따라 시간과 속도를 변경, 반복해야 할 수 있습니다.주의: 원심분리기가 균형을 잘 유지하도록 하십시오. 주사기와 바늘 또는 파이펫을 사용하여 모세관 튜브의 하이드로겔 위에 PBS 200-300 μL을 조심스럽게 채웁니다. 하이드로겔 표면에 접촉하거나 방해하지 마십시오. 캡으로 튜브를 밀봉하거나 플러그 또는 덮개를 두 겹의 파라핀 필름으로 밀봉합니다. (선택 사항) 37°C에서 샘플을 배양하여 생체 조건에서 시뮬레이션합니다. 하이드로겔 표면을 방해하지 않고, 약물 방출의 예상 시간 척도에 따라 선택한 시점에서 주사기와 바늘을 사용하여 각 모세관에서 PBS를 조심스럽게 완전히 제거합니다. 제거된 볼륨을 신선한 PBS로 교체합니다. 적절한 조건하에서 알리쿼트를 저장합니다.참고: 4.3, 4.5 및 4.7 단계의 권장 볼륨 및 시간 점은 재료에 적재되는 약물의 양과 상퍼로 얼마나 빨리 방출되는지에 따라 다양한 기간 동안 체외 약물 방출을 캡처하도록 최적화 할 수 있습니다. 선택된 시간 점의 견본은 느린 방출 약에 대한 6 h, 1 일, 3 일, 1 주 및 2 주 일 수 있습니다. 알리쿼트도 저장되지 않고 획득할 때 분석할 수 있습니다. 연구가 완료되면, ELISA, HPLC 또는 형광 분석과 같은 적절한 방법으로 알리쿼트를 분석하여 각 시점에서 방출되는 약물의 양을 정량화하도록40,41,42. 적절한 검출 방법은 관심약물에 따라 달라집니다.참고: 시험관 내 방출 연구는 다른 하이드로겔 제형 또는 약물 화물 간의 방출을 비교하는 데 유용합니다. 시험관 내 방출 일정은 생체 내에서 예상되는 릴리스 규모를 직접 나타내지 않는 경우가 많습니다. 5. 젤 캡슐화된 인슐린의 열 안정성 특성화 샘플 그룹당 PNP 하이드로겔의 최소 1.2mL를 제조한다. 섹션 2.3에 기술된 절차에 따라 인슐린(약물 화물)과 티오플라빈 T(ThT)(분자 프로브)를 PNP 하이드로겔에 로드합니다.참고: 응집의 기본 메커니즘, 따라서, 인슐린의 불활성화는 아밀로이드 섬유의 형성을 통해. ThT는 아밀로이드 피브릴이 있는 상황에서 강력한 형광 신호를 생성하기 때문에 적합한 분자 프로브로, 인슐린 응집의 시상 모니터링을 가능하게 한다. 관심있는 약물화물에 따라, 집계는 다른 방법을 통해 모니터링 될 수있다. 표시된 대표적인 데이터에 대해, 인슐린은 6.7 또는 10 mg/mL 및 ThT의 최종 농도를 25 μM의 최종 농도로 로드하였다. 21 G 바늘을 사용하여, 검은 96 웰 플레이트에 잘 당 PNP 하이드로겔 200 μL을 주입. 각 샘플 그룹은 적어도 삼중으로 측정되어야 합니다. 증발을 방지하기 위해 광학적으로 명확한 접착제 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉하십시오. 온도 제어, 흔들림 및 운동 읽기 프로그래밍이 장착된 플레이트 판독기에 플레이트를 삽입하고 읽기 프로토콜을 시작합니다. 대표 데이터는 다음과 같은 조건을 사용하여 시판 가능한 플레이트 판독기(재료 표 참조)로 수집되었습니다. 응력 노화 조건 : 37 °C에서 연속 선형 흔들림 (410 cpm, 5mm) 데이터 수집: 20분 간격으로 450nm/482 nm참고: 온도 제어, 셰이커 및 운동 읽기 기능이 있는 플레이트 판독기를 사용할 수 없는 경우 플레이트를 인큐베이터의 셰이커 플레이트에 놓고 선택한 시점의 위 파장에서 수동으로 읽을 수 있습니다. 각 그룹에 대한 시간이 지남에 따라 데이터를 평균 형광 신호로 플롯합니다. 집계 시간은 임의 신호임계값(43)을정의하여 정량화될 수 있다.참고: 아래에 표시된 대표 데이터의 경우 임계값은 750,000개의 임의 형광 단위(AFU)로 정의되었습니다. 이 값은 선명한 형광 신호 증가로 표시된 집계의 발병을 충분히 캡처하면서 측정 기준선 이상으로 선택되었습니다. 샘플이 집계되거나 시각적으로 탈수되기 시작할 때 분석서를 종료합니다. 6. 세포 생존 가능성 평가 위의 프로토콜(일반적으로 1 – 5 x 106 세포/mL)에 이어 원하는 세포 농도를 포함하는 PNP 하이드로겔의 최소 2mL를 공식화한다. 각 샘플 그룹을 별도의 주사기로 준비합니다. 21G 바늘을 사용하여, 명확한 하단 96 웰 플레이트에 각 우물에 150 μL PNP 하이드로겔을 주입; 각 웰은 하나의 복제입니다. 각 샘플 그룹에는 시간당 3-5 복제가 있어야 합니다. 50 x g의 플레이트를 2분 동안 원심분리하여 하이드로겔을 웰에 고르게 퍼집니다. 하이드로겔 위에 적절한 셀 미디어의 100 μL을 추가합니다. 매일 이 미디어를 제거하고 100 μL 새 미디어를 추가합니다. 1일째에, 각 샘플 그룹에 대한 해당 시점에 대해 지정된 복제에 대해 하이드로겔 위에 있는 미디어를 제거한다. 하이드로겔 위에 2mM 칼신 AM 용액의 50 μL을 추가합니다. 30분 동안 배양합니다.참고: Calcein AM을 사용하여 라이브 셀을 식별하고 레이블을 지정할 수 있습니다. 살아있는 세포에서, 비 형광 칼세인 AM은 아세톡시메틸 에스테르 가수분해 후 세포 내 에스테라아제에 의해 녹색 형광 칼세인으로 변환된다. 공초점 현미경을 사용하여 96 웰 플레이트에서 각 우물의 중심을 이미지합니다. 최소 300 μm2의 면적을 조사하여 최소 150 μm에 달하는 z 스택을 조사합니다. 공초점 파장 설정을 사용하여 칼세인의 형광을 캡처합니다(여기/방출: 495 nm/515 nm). 원하는 대로 각 후속 시간점에 대해 6.4 및 6.5 단계를 반복합니다. 각 이미지를 분석하려면 모든 z 스택 이미지를 FIJI 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 단일 평면 최대 강도 이미지로 축소합니다. 각 이미지에서 형광 세포의 수를 정량화합니다. 1일째에 형광세포의 수에 비해 매 시점에서 형광세포의 수의 비율은 PNP 하이드로겔의 상대적인 세포 생존율이다. 7. 세포 정착 평가 5 x 106 셀/mL의 최종 농도에서 PNP 하이드로겔의 500-700 μL을 공식화하는 데 필요한 셀 수를 계산합니다. 1 x 106 세포/mL의 농도로 PBS의 1 mL에서 세포를 중단합니다. 2mM 칼세인 AM의 50 μL을 추가하여 얼룩 세포. 10 분 동안 염료로 세포를 배양합니다. 적절한 조건에서 원심분리기 세포는 PBS를 제거하고 원하는 PNP 하이드로겔의 500-700 μL을 형성하는 데 필요한 PBS부피의 세포를 재일시 중단한다.참고: 각 특정 셀 유형의 원심분리기의 권장 속도와 기간은 일반적으로 제품 설명서에 제공됩니다. 프로토콜 섹션 2 다음 스테인드 셀(5 x 106 cells/mL)을 가진 PNP 하이드로겔의 500-700 μL을 공식화한다. 21G 바늘을 사용하여, 큐벳의 바닥에 스테인드 세포를 포함하는 PNP 하이드로겔의 100-200 μL을 주입한다. 각 샘플에 대해 세 개의 복제를 수행해야 합니다. 거품 형성을 방지하기 위해 주입하는 동안 큐벳 내에서 앞뒤로 바늘을 이동합니다. 즉시(시간 t=0) 큐벳 의 기저에 있는 전체 플랫 큐벳 직사각형 영역에 누워 있는 큐벳을 이미지합니다. 공초점 타일 스캐닝 기능을 사용하여 전체 웰 영역을 이미지화하고 100 μm 깊이에 걸쳐 3D로 z 스택을 이미지합니다. 이후 시각화의 경우, 공초점 현미경 소프트웨어를 사용하여 모든 개별 타일을 함께 꿰매고 최대 강도 프로젝션을 수행하여 넓은 면적의 단일 이미지를 형성하거나 개인용컴퓨터(44,45)에서FIJI 소프트웨어를 사용합니다. 이미징을 마친 후 큐벳을 똑바로 세워보시면 됩니다. 1 시간 및 4 h에서 의 이미지는 세포가 하이드로겔에 정착했는지 또는 일시 중단 된 상태로 남아 있는지 관찰합니다.참고: 이러한 시간 포인트는 제안이며 원하는 대로 수정할 수 있습니다. 각 이미지를 분석하려면 모든 z 스택 이미지를 단일 평면 최대 강도 이미지로 축소합니다. FIJI 또는 이와 유사한 소프트웨어를 사용하여, 쿠벳의 중심 수직 프로파일 아래로 형광 강도를 측정하여 세포 분포를 정량화하여 침전 정도를 결정한다.

Representative Results

PNP 하이드로겔 제작 및 특성화PNP 수압겔은 2개의 1차 성분인 소수성 변형 HPMC 폴리머 및 PEG-PLA나노입자(도 1a)의혼합을 통해 형성된다. 치료화물은 하이드로겔 제조 전에 나노입자 성분을 희석하는 데 사용되는 추가 완충액에 가장 쉽게 통합된다. 다운스트림 생체 의학 특성화를 위해, 두 성분(도 1b)의 간단하고 재현 가능한 혼합을 가능하게 하는 팔꿈치 혼합 방법을 사용하는 것이편리하다. 적절한 혼합 후, 하이드로겔은 주사기에서 단단하게 느껴져야 하지만, 압력하에서 수율과 표준 바늘(21G 도시)으로부터 돌출하였다(도1c). 주입 후 하이드로겔은 중력에서 흐르는 것을 저항하는 고체와 같은 재료로 빠르게 설정해야합니다. 하이드로겔을 완전히 특성화하고 일관된 배치-배치 제품을 보장하기 위해 류미터에서 여러 가지 실험을 사용하여 샘플을 분석해야 합니다. 겔의 전단 숱이 나고 자가 치유 능력은 각각 유동 스윕 프로토콜 및 스텝 전단 프로토콜을 사용하여 쉽게 관찰될 것이다(도2a,b). 2:10 제제와 같은 딱딱한 젤의 경우, 전단 속도가 0.1에서 100s-1로증가함에 따라 유동 스윕 중에 적어도 두 배의 진도를 감소시키는 점도를 찾아야 하며, 이는 주입 중 기계적 조건을 시뮬레이션한다. 스텝 전단 프로토콜은 고전단 단계하에서 점도의 수주 감소와 낮은 전단 단계 동안 기준점도에 대한 빠른 반환(<5s 복구 시간)을 공개해야 합니다. 선형 점탄성 정권에서 진동 전단 주파수 스윕 실험을 이용한 저장 및 손실 계열의 특성화는 0.1-100 rads-1(도 2c)의주파수 범위에서 고체와 같은 특성을 드러내야 한다. 특히, 전형적으로 2:10 하이드로겔과 같은 단단한 제형에 대한 낮은 주파수에서 관찰할 수 있는 전단 저장 및 손실 계둘리의 크로스오버가 없어야 한다. 이러한 크로스오버 이벤트는 변형된 HPMC 또는 PEG-PLA 폴리머, 또는 PEG-PLA 나노입자의 크기 및 분산성 중 에서 시작 물질의 품질에 문제를 나타낼 수 있다. 1:5 하이드로겔과 같은 약한 하이드로겔 제형에 대해 크로스오버 이벤트가 예상될 수 있다는 점에 유의해야 한다. PNP 하이드로겔의 진동 전단 진폭스윕은 높은 응력 값이 적용될 때까지 재료가 굴복하지 않는다는 것을 나타내며, 이는 이러한 물질이 수율 응력을 가지고 있음을 나타내며, 이는 재료가 흐르는 데 필요한 응력의 임계값입니다. PNP 하이드로겔의 방출 역학 특성화약물 전달을 위한 PNP 젤을 설계하는 데 필수적인 단계는 선택한 제제로부터 의약 방출 운동제의 특성화입니다. 이를 위한 몇 가지 기술이 있지만, 간단한 체외 방법론은 조기 제형개발(도 3a)에서유용한 데이터를 제공한다. HPMC-C12 또는 NPs의 양을 조절하여 PNP 하이드로겔의 폴리머 함량을 다양화하는 것은 이러한 하이드로겔의 기계적 특성 및 메쉬 크기를 조정하는 가장 간단한 방법이며, 이는 폴리머 네트워크를 통한 화물의 확산및 재료로부터의 방출 속도에 직접적인 영향을 미칠 수있다(도 3b). 동적 메쉬 크기(예: 높은 분자량 또는 대형 유체 역학 반경)보다 큰 화물의 경우, 연구자들은 하이드로겔 창고에서 화물의 느리고 용해 매개 방출을 기대해야 합니다. 다이나믹 메쉬 크기를 화물의 크기보다 크거나 동일한 제형은 기존의 화물 확산 모델을 사용하여 설명할 수 있는 확산 매개 방출을 허용하고46,47,48,49를방출할 수 있다. 방출 곡선의 형상에 기초하여, 연구원은 하이드로겔을 재구성하여 더 느린(예를 들어, 폴리머 함량을 증가) 또는 더 빨리(예를 들어, 폴리머 함량을 감소) 방출쪽으로 조정할 수 있다. 치료화물의 안정성 평가하이드로겔 제형에서 치료화물의 안정성을 결정하는 것은 전임상 또는 세포 연구를 시작하기 전에 매우 중요합니다. PNP 하이드로겔은 약물을 캡슐화하기 위한 다른 합성 방법에 비해 벌크 재료에 혼합하여 화물을 부드럽게 통합하며 캡슐화로 인해 화물이 손상될 가능성은 낮습니다. 이러한 연구는 PNP 하이드로겔이 인슐린과 같은 열 불안정에 취약한 화물을 안정화할 수 있으며, 유통 기한을 상당히 연장하고 냉장 보관 및 유통에 대한 의존도를 감소시킬 수 있음을나타낸다(그림 4). 하이드로겔에 캡슐화한 직후뿐만 아니라 장기간 보관한 후 화물의 상태를 평가하는 것이 중요합니다. 이러한 데이터는 인슐린 응집측정을 위한 간단한 형광 분석을 사용하여 지속적인 열 및 기계적 스트레스 하에서 28일간의 저장 후 하이드로겔에서 안정적으로 유지된다는 것을 보여줍니다. 적절한 판 분석이 불가능한 경우를 위한 대체 기술은 단백질 약물의 이차 구조를 결정하는 데 특히 유용한 화물의 원형 이차측정을 수행하는 것이다. PNP 하이드로겔의 세포 생존 가능성 및 분산 결정많은 치료 세포는 생존하기 위해 접착 모티프를 필요로하며, 따라서 아르기닌 글리신 -아스파르트산 (RGD) 펩티드와 같은 인테그린 모티프의 포함은 세포 요법을위한 PNP 하이드로겔을 적응시키는 중요한 단계이다50. 모듈식PEG-P를포함하는 PLA 폴리머는 간단한 “클릭”화학28,51을통해 PEG 코로나의 화학적 기능화를 가능하게 한다. 이 예에서, 세포-접착제 RGD 펩타이드는 PNP 하이드로겔 구조와의 세포 결합을 촉진하기 위해 PEG-PLA 폴리머에 부착되었다. 접착 부위가 부족한 제형은 캡슐화된 세포가 이러한 접착 모티프(도5a,b)를갖는 제형에 캡슐화된세포에 비해 증식하는 데 실패함에 따라 낮은 세포 생존율을 가질 것이다. 캡슐화된 세포는 형광 현미경으로 세포 계수를 용이하게 하기 위해 칼세인 AM 또는 다른 적절한 형광염(예를 들어, CFSE)으로 표지될 수 있다. 최적화 하는 동안, 생존력 은 통합 된 기능성 제형이 향상된 생존력과 확산을 제공하고 있는지 확인하기 위해 수정되지 않은 PNP 하이드로겔과 비교되어야합니다. 통합 기능성 제형이 수정되지 않은 하이드로겔과 유사한 효능을 제공하는 경우, 이는 유착 모티프를 통합하는 데 사용되는 유도 화학의 실패를 나타낼 수 있다. 연구원은 캡슐화된 세포가 적절한 하이드로겔 제형을 사용할 때 하이드로겔 배지를 통해 균등하게 분산될 것으로 예상해야 한다. 이것은 하이드로겔 투여 도중 세포의 일관되고 예측 가능한 투여를 허용할 것이고 행정 후에 하이드로겔에 있는 세포의 현지 보존으로 번역되어야 합니다. 세포의 분포는 형광 현미경 기술을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다. 세포는 적당한 염료로 표지되고 공초점 현미경 검사를 사용하여 심화될 수 있습니다. 이미지는영상(도 5c)과영상의 수직 축을 따라 평균 형광 강도를 측정하기 위해 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 시각적으로 평가할 수 있다(도 5c) 및 또한 정량적으로(도 5d)…또는 중력에 의한 축 세포 침전이 발생할 것으로 예상되는 축 세포 침전이 발생할 것으로 예상된다.] 하이드로겔 제형이 장기간 에 걸쳐 현탁액에서 세포를 지원하기에는 너무 약한 경우, 도 5에서1:1 제형에서 관찰된 바와 같이 세포 침전이 발생할 것이다. 폴리머 함량을 늘리면 침전으로 인한 불균일한 세포 분산 문제를 해결할 수 있습니다. 도 1: 폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔은 두 가지 성분을 혼합하여 쉽게 형성된다. (a)제1 성분은 도데릴 변형 된 하이드록시 프로필메틸 셀룰로오스 (HPMC-C12)의용액이며, 두 번째 성분은 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록 폴리 (락티산) (PEG-나노 입자)의 용액이다. 이 두 성분의 부드러운 혼합은 주사용 하이드로겔을 생성하며, 여기서 HPMC-C12 폴리머는 PEG-PLA 나노 입자와의 동적다목적, 다자간 상호 작용으로 물리적으로 교차된다. (b)PNP 하이드로겔의 1성분을 함유한 각 주사기 2개와 혼합하여 겔 제형을 시연하는 사진. 두 주사기를 Luer-lock 팔꿈치 커넥터와 연결함으로써 두 성분을 멸균 조건하에서 쉽게 혼합하여 즉시 사용하기 위해 주사기에 미리 로드된 거품이 없는 하이드로겔을 생성할 수 있습니다. NP 용액은 데모를 위해 파란색으로 염색됩니다. (c)PNP 하이드로겔의 주입 및 재고화의 시연. (i) PNP 하이드로겔이 부착된 21G 바늘을 장착한 주사기에 부착된 다. (ii) 주사는 일시적으로 중합체와 나노 입자 사이의 상호 작용을 중단 전단 아래에 하이드로겔을 배치, 유체 와 같은 일관성을 생성. (iii) 후 사출, 동적 중합체 나노 입자 상호 작용은 빠르게 개혁되어 하이드로겔이 고체로 자가 치유할 수 있게 합니다. (iv) 고체 하이드로겔은 중력과 같은 수율 응력보다 약한 힘 하에서 흐르지 않습니다. PNP 하이드로겔은 데모를 위해 파란색으로 염색됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 2: 2개의 PNP 하이드로겔 제형의 유변학적 특성화. 제형은 폴리머 wt%로 표시됩니다.%: NP wt.%. (a)PNP 하이드로겔의 낮은 전단 속도에서 높은 전단 속도로 꾸준한 전단 흐름이 스윕됩니다. 전단 속도의 함수로서의 점도는 전단 숱이 특성을 특징으로합니다. (b)PNP 하이드로겔의 자가 치유특성을 입증하는 높은 전단 속도(빨간색 배경; 10s-1)에낮은 전단 속도(흰색 배경, 0.1s-1)사이의 진동 전단 속도를 진동시키는 기능으로서 점도. 전단 요금은 각각 30s에 부과됩니다. (c)탄성 스토리지 계달수 G+ 점성 손실 계수 G” 다양한 PNP 하이드로겔 제형에 대한 일정한 1 % 변형에서 주파수의 함수로. (d)진폭은 10 개의 rad /s의 일정한 주파수에서 스윕하여 탄력적 인 저장 modulus G′와 점성 손실 계수 G”의 응력의 함수로 스윕합니다. 이 유변학적 특성화는 품질 관리를 위한 비교로 사용될 수 있습니다. 이 그림은 Grosskopf 등에서적응되었습니다. 28이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: PNP 하이드로겔에서 소 혈청 알부민 (BSA)의 체외 방출. 제형은 폴리머 wt%로 표시됩니다.%: NP wt.%. (a)실험체 방출 프로토콜을 설명하는 회로도. 알리쿼트는 시간이 지남에 따라 PNP 하이드로겔로 로드된 모세관 튜브에서 제거됩니다. (b)1:10 PNP, 2:5 PNP 및 2:10 PNP로부터 BSA의 체외 방출은 분석 시 수집된 총 질량으로 나눈 지정된 시점에 의해 수집된 질량으로 보고된다(평균 ± SD로 표시된 데이터; n = 3). BSA는 흡광도 측정을 통해 검출되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: ThT 분석에 의해 PNP 하이드로겔에 캡슐화된 인슐린의 열 안정성. 제형은 폴리머 wt%로 표시됩니다.%: NP wt.%. 인슐린은 1:5 와 2:10 PNP 하이드로겔에서 모두 37°C의 스트레스노화 조건과 지속적인 동요에서 28일 동안 집계되지 않은 채로 남아 있었다. PBS에서 공식화된 인슐린을 위한 집계 시간은 20 ± 4시간이었습니다 (평균 ± SD, 집계 임계값 750,000 AFU). 평균 n = 4개의 실험 복제(AFU, 임의형 형광 단위)로 제시된 데이터. 이 그림은 Meis 등에서적용되었습니다. 38이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: PNP 하이드로겔에 세포 생존가능성 및 세포 침전. (a,b)인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)를 가진 PNP 하이드로겔의 세포 생존성 연구. (a)1:5 PNP 하이드로겔의 대표적인 이미지는 PEG-PLA NP에 컨쥬어드된 세포-접착제 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 모티프를 유의하여 공초점 이미징에 30분 전에 칼신 염색하였다. 스케일 바는 1일째에 형광세포의 수에 비해 이미지내형세포의 수로 정의된 6일째100 μm.(b)세포 생존가능성을 나타낸다(평균 ± SD로 표시된 데이터; n = 3). (c,d) hMSC를 장착하고 정착실험. (c) 칼신 AM 염색 hMSC의 최대 강도 이미지는 1:1 PNP 하이드로겔(상단 행)과 1:5 PNP 하이드로겔(아래 줄)으로 캡슐화되어 세포 침전을 정량화한다. 스케일 바는 하이드로겔의 수직 프로파일을 따라 hMSC의 평균 수평 픽셀 강도 1mm를 나타낸다. 이 그림은 Grosskopf 등에서적응되었습니다. 28이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔은 직접 주입 또는 카테터 전달을 통해 최소 침습 적 투여를 통해 치료 세포 및 약물의 장기 국소 전달을 용이하게 제조하고 가능하게 한다. 이러한 프로토콜은 PNP 하이드로겔의 제형과 결과 물질의 품질을 보장하기 위한 특성화 방법을 설명합니다. 수퍼컬분자 PNP 하이드로겔은 제조할 수 있으며 변형된 셀룰로오스 폴리머 및 폴리머 코어 쉘 나노입자의 간단한 혼합을 통해 형성된다. 본 방법은 간단한 팔꿈치 혼합 프로토콜을 통해 주사기에 미리 로드된 젤을 형성하는 촉진 절차를 설명합니다. DLS와 같은 각 부품의 품질 관리 메트릭을 통해 NP 크기 및 분포를 모니터링할 수 있으며, 일관된 유변학적 특성으로 PNP 하이드로겔 재료를 재현가능하게 제조할 수 있습니다. HPMC-C₁₂ 또는 NP의 양을 다양하게 하여 결과 PNP 하이드로겔의 메쉬 크기와 강성을 조절할 수 있습니다. 이러한 특성은 특정 생체 의학 응용 분야에 가장 잘 맞게 조정할 수 있으며, 여기에 자세히 설명된 유변학적 방법으로 연구자들은 PNP 하이드로겔의 전단 숱이 및 자가 치유 특성을 특성화하여 특정 응용 분야에 대한 플랫폼을 최적화할 수 있습니다. 체외 방출 연구를 위한 방법 또한 설명 됩니다.; 연구원은 이러한 연구를 사용 하 여 관심 있는 약물의 출시의 상대적인 기간을 특성화 하는 데 사용할 수 있습니다., 생체 내 연구에서 미래를 알리는. 안정성 연구를 사용하여 연구원은 또한 생체 치료제의 콜드 체인 의존성을 줄이기 위한 강력한 잠재적 응용 프로그램과 함께, 시간이 지남에 따라 민감한 생물 치료제의 생물학적 구조와 안정성을 보존하는 데 도움이 이러한 물질의 능력을 평가할 수 있습니다. 마지막으로, 간단한 세포 생존 가능성 분석으로, 세포 성장 및 PNP 물질 내의 이주를 평가할 수 있습니다, 세포 치료 및 발판에 있는 잠재적인 응용으로.

우리 그룹은 PNP 하이드로겔 플랫폼^27에대한 많은 강력한 응용 프로그램을 발견했다. PNP 하이드로겔은 아체유닛 백신의 느린 전달을 위해 사용되어, 항원 및 보조제의 매칭 된 운동 방출 프로파일을 가능하게하여 유머 면역 반응^(31)의크기, 지속 시간 및 품질을 향상시킵니다. PNP 하이드로겔은 가장 일반적으로 사용되는 하이드로겔보다 메쉬 크기가 더 작은 것으로 나타났기 때문에 확산을 늦추고 분자 화물을 천천히 방출하는 데 효과적입니다. PNP 하이드로겔의 독특한 조직 부착 특성 및 기계적 특성은 수술 후 장기의 넓은 표면 영역에 하이드로겔을 분사하여 수술로 인한 접착을 방지하기 위해 물리적 장벽을 형성하는 데^{활용되었다(30)} PNP 하이드로겔은 또한 효과적인 세포 전달 차량으로 나타났으며, 기계적 특성은 실제로 주입 시 주사기 바늘에서 발생하는 기계적 힘으로부터 세포를 보호하여 셀^{생존가능성을}향상시키는 것으로 나타났다. NPs가 세포 접착제 펩티드와 결합될 때, 세포는 PNP 매트릭스를 부착하고 관여하여 실행 가능한 상태를 유지할 수 있다. 이러한 접근법을 이용하여, PNP 하이드로겔은 액체^{차량(28)을}이용한 방법에 비해 주입된 줄기세포의 국소 보존을 개선하는 것으로 나타났다. 또한, PNP 하이드로겔은 가혹한 응력 노화 조건 하에서도 캡슐화된 인슐린의 열유도 응집을 방지하는 것으로 나타났으며, 이러한 물질이 온도에 민감한^{약물(38)을}냉장할 필요성을 줄일 수 있음을 시사한다.

전반적으로, 여기에 설명된 방법론은 연구 그룹이 생물 재료로 PNP 하이드로겔을 제조하고 탐구할 수 있게 해 줄 것이다. 이러한 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 연구를 모두 추구하기에 충분한 하이드로겔 물질을 제조하기 위한 실험실 규모의 합성 기술을 제공합니다. 위에서 설명한 연구는 이러한 물질의 동적 교차링크가 분자 화물의 수동 확산을 제한하면서 갇힌 세포의 활성 운동성을 허용함으로써 다양한 생체 의학 응용 분야에 적합할 수 있음을 나타냅니다. 연구원은 PNP 플랫폼이 통제된 약 납품을 통해 임상 결과를 향상하고 세포 모집 및 기계생물학과 같은 기본적인 생물학 기계장치를 공부하기 위하여 접근가능하고 강력한 공구를 찾아냅니다.

Materials

21G needles	BD	305165	PNP hydrogel injection
22G, 4 in hypodermic needles	Air-Tite	N224	In vitro release studies
384-well plates, black, clear bottom	Corning	3540	Dynamic light scattering (DLS)
96-well plates, black	Fisher Scientific	07-200-627	Biostability studies
96-well plates, clear	Corning	3599	Cell viability and settling studies
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C3100MP	Cell viability and settling studies
Capillary tubes	McMaster-Carr	8729K66	In vitro release studies
Centrifugal filter units	Fisher Scientific	UFC901024	NP concentration
Cuvettes	Millipore Sigma	BR759015-100EA	Cell viability and settling studies
DLS Plate Reader	Wyatt Technology	DynaPro II Plate Reader	Dynamic light scattering (DLS)
Epoxy	VWR International	300007-392 (EA)	In vitro release studies
Hypodermic needles	Air-Tite	8300015027	In vitro release studies
Luer elbow connector	Cole-Parmer	EW-30800-12	PNP hydrogel formulation
Luer lock syringe	Fisher Scientific	14-955-456	PNP hydrogel formulation
Phosphate Buffered Saline (1x)	Fisher Scientific	10010049	PNP hydrogel formulation
Plastic Spatula	Thomas Scientific	1229F13	Rheological characterization
Plate Reader	BioTek	Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader	Biostability studies
Plate seals	Excel Scientific	TS-RT2-100	Biostability studies
Recombinant human insulin	Gibco	A11382II	Biostability studies
Rheometer	TA Instruments	DHR-2 Rheometer	Rheological characterization
Thioflavin T	Sigma-Aldrich	T3516-5G	Biostability studies