本协议描述了可注射超分子-纳米粒子(PNP)水凝胶生物材料的合成和配方。这些材料在药物输送、生物制药稳定、细胞封装和输送方面具有应用性。
这些方法描述了如何制造成注射性超分子-纳米粒子(PNP)水凝胶用作生物材料。PNP水凝胶由两个组成部分组成:疏水性改性纤维素作为网络聚合物和自组装的核心壳纳米粒子,通过动态、多价相互作用充当非共效交叉链接器。这些方法既描述了这些自组装纳米粒子通过纳米沉淀的形成,也描述了两个组件的配方和混合,以形成具有可调谐机械特性的水凝胶。还详细使用动态光散射 (DLS) 和风湿学来描述合成材料的质量。最后,通过体外实验,证明了这些水凝胶对药物输送、生物制药稳定、细胞封装和输送的效用,以描述药物释放、热稳定性、细胞沉降和生存能力。由于其生物相容性、注射性和温和凝胶形成条件,该水凝胶系统是一个易于调谐的平台,适合多种生物医学应用。
注射水凝胶是一种新兴的工具,以受控的方式向身体输送治疗细胞和药物1。这些材料可以装载药物或细胞,可以通过直接注射到表面组织或导管输送到深层组织以微创的方式施用。一般来说,可注射水凝胶由水膨胀的聚合物网络组成,这些聚合物网络通过瞬时物理相互作用相互交织在一起。在休息时,这些交叉链接为凝胶提供一个类似固体的结构,但在应用足够的机械力时,这些交叉链接会暂时中断,将材料转换为液体状状态,可以很容易地流动2。正是这些风湿特性,使物理水凝胶切变薄,并在注射3期间流经小针直径。注入后,对聚合物网络的材料进行改造,使其自我愈合,并迅速形成原位4、5的固体状凝胶。这些结构可以作为药物的缓慢释放库或组织再生的脚手架6,7。这些材料已应用于不同的应用,包括药物输送技术,再生医学和免疫工程1,8,9,10,11,12。
天然材料(如藻酸盐和胶原蛋白)和合成材料(如聚乙二醇(PEG)或类似的亲水聚合物)都已开发为生物相容注射水凝胶材料13,14,15。许多天然材料表现出批次变化,影响可重复性4,16。这些材料通常对温度敏感,在达到生理温度时进行固化:因此,处理这些材料会带来额外的技术和后勤挑战。合成材料允许更精确的化学控制和出色的可重复性,但这些材料有时可能受到不利的免疫反应,限制其生物相容性,一个关键的特点,在体内治疗应用6,18,19。最近的努力表明,在工程中涉及许多复杂的设计标准,包括优化机械性能,聚合物网络网格大小,生物活性分子线索,生物降解性,和免疫原性的材料20,21,22,23,24,25,26。所有这些因素都必须根据兴趣的应用来考虑,这意味着模块化、化学可调谐的平台是满足广泛应用的理想选择。
本方法描述了可注射聚合物纳米粒子(PNP)水凝胶平台的配方和使用,该平台具有可调谐的机械特性、高度的生物相容性和低免疫原性,并提出了生物活性分子线索27、28、29、30、31、32、33的结合点。这些PNP水凝胶由疏水性改性纤维素聚合物和自组装的核心壳纳米粒子组成,包括聚(乙二醇)-块-聚(乳酸)(PEG-PLA)27,34,相互作用,产生超分子网络。更具体地说,多德西尔改性羟基甲基纤维素聚合物(HPMC-C12)与PEG-PLA纳米粒子表面动态相互作用,并在这些纳米粒子之间架起桥梁,形成这个聚合物网络27,34。这些动态的多价相互作用使材料在注射过程中剪切变薄,并在给药后快速自我修复。PNP水凝胶组件通过简单的单锅反应很容易制造,PNP水凝胶是在温和条件下通过简单混合两个成分35而形成的。由于易于制造,该水凝胶平台具有高度可翻译的规模。PNP水凝胶的机械特性和网格尺寸通过改变配方中聚合物和纳米粒子组件的重量百分比来控制。先前与这个平台的研究表明,PNP水凝胶是高度生物相容的,可生物降解的,非免疫性28,30,31。总的来说,这些水凝胶在生物医学应用中具有广泛的效用,包括术后粘附预防、组织工程和再生、持续药物输送和免疫工程。
聚合物-纳米粒子 (PNP) 水凝胶易于制造,通过直接注射或导管输送,通过微创施用,使治疗细胞和药物能够长期局部输送。这些协议描述了PNP水凝胶的配方和确保所生成材料质量的定性方法。超分子PNP水凝胶可扩展制造,通过改性纤维素聚合物和聚合物核心壳纳米粒子的简单混合而形成。目前的方法描述了通过简单的肘部混合协议形成注射器预装凝胶的简单程序。通过对每个组件(如 DLS)的质量控制指标来监控 NP 大小和分布,可以重复地制定具有一致风湿特性的 PNP 水凝胶材料。通过改变 HPMC-C12或 NP 的量,可以调节由此产生的 PNP 水凝胶的网格大小和刚度。这些特性可以调整,以最适合特定的生物医学应用,并与此处详细的风湿方法,研究人员可以描述PNP水凝胶的剪切稀释和自我修复特性,因为他们优化其特定应用的平台。还介绍了体外释放研究的方法:研究人员可以利用这些研究来描述相关药物释放的相对时间尺度,为未来体内研究提供参考。利用稳定性研究,研究人员还可以评估这些材料在时间和极端温度下帮助保持敏感生物疗法的生物结构和稳定性的能力,并具有降低生物治疗药物冷链依赖性的潜在应用。最后,通过简单的细胞生存能力检测,可以评估PNP材料中的细胞生长和迁移,在细胞疗法和脚手架中具有潜在的应用。
我们的团队已经发现了许多引人注目的应用,PNP水凝胶平台27。PNP水凝胶已用于缓慢交付亚单位疫苗,使抗原和辅助剂的匹配动能释放配置文件,以提高幽默免疫反应31的幅度,持续时间和质量。PNP水凝胶的网状尺寸比大多数常用的水凝胶要小,因此它们能够有效地减缓扩散和缓慢释放分子货物。PNP水凝胶独特的组织粘附特性和机械特性也被用来形成物理屏障,防止手术产生的粘附性,在手术后将水凝胶喷洒到器官的大片表面区域。PNP水凝胶也被证明是有效的细胞输送工具,机械特性实际上保护细胞免受注射过程中注射针中发生的机械力的伤害,提高细胞的生存能力29。当 NP 与细胞粘合肽结合时,细胞可以连接并与 PNP 基质接合以保持可行。使用这种方法,PNP水凝胶已被证明,以改善注射干细胞的局部保留相比,使用液体车辆的方法28。此外,PNP水凝胶已被证明可以防止热诱导聚集的封装胰岛素,即使在苛刻的压力老化条件下,表明这些材料可能能够减少冷藏温度敏感药物38的需要。
总的来说,这里描述的方法将允许研究小组制造和探索PNP水凝胶作为生物材料。这些协议提供实验室规模的合成技术,以制造足够的水凝胶材料,以追求体外和体内研究。上述研究表明,这些材料的动态交联使得它能够适应一系列生物医学应用,允许受困细胞的主动动力,同时限制分子货物的被动扩散。预计研究人员将发现PNP平台是一个可访问和强大的工具,通过控制药物输送改善临床结果,并研究基本的生物机制,如细胞招募和机械生物学。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了比尔和梅林达·盖茨基金会(OPP1113682)和比尔·梅林达·盖茨基金会(OPP1211043)人类系统免疫学中心的财政支持。C.M.M得到了斯坦福大学研究生奖学金和斯坦福生物X威廉和林达·斯蒂尔奖学金的支持。A.K.G. 感谢国家科学基金会研究生研究奖学金和斯坦福大学科学与工程研究生奖学金的加比兰奖学金。S.C由国家卫生研究院国家癌症研究所根据第32CA247352号奖获得支持。作者还要热情地感谢阿佩尔实验室的成员,包括吉利·罗斯博士、安东尼·余博士、林赛·斯台普顿博士、赫克托·洛佩兹·埃尔南德斯博士、安德里亚·达基诺博士、朱莉·拜莱特博士、席琳·连、本·欧、艾米莉·梅尼、艾米莉·盖尔博士和安东·史密斯博士多年来为帮助阿佩尔实验室开发这些协议所付出的努力和时间。
21G needles | BD | 305165 | PNP hydrogel injection |
22G, 4 in hypodermic needles | Air-Tite | N224 | In vitro release studies |
384-well plates, black, clear bottom | Corning | 3540 | Dynamic light scattering (DLS) |
96-well plates, black | Fisher Scientific | 07-200-627 | Biostability studies |
96-well plates, clear | Corning | 3599 | Cell viability and settling studies |
Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Cell viability and settling studies |
Capillary tubes | McMaster-Carr | 8729K66 | In vitro release studies |
Centrifugal filter units | Fisher Scientific | UFC901024 | NP concentration |
Cuvettes | Millipore Sigma | BR759015-100EA | Cell viability and settling studies |
DLS Plate Reader | Wyatt Technology | DynaPro II Plate Reader | Dynamic light scattering (DLS) |
Epoxy | VWR International | 300007-392 (EA) | In vitro release studies |
Hypodermic needles | Air-Tite | 8300015027 | In vitro release studies |
Luer elbow connector | Cole-Parmer | EW-30800-12 | PNP hydrogel formulation |
Luer lock syringe | Fisher Scientific | 14-955-456 | PNP hydrogel formulation |
Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher Scientific | 10010049 | PNP hydrogel formulation |
Plastic Spatula | Thomas Scientific | 1229F13 | Rheological characterization |
Plate Reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader | Biostability studies |
Plate seals | Excel Scientific | TS-RT2-100 | Biostability studies |
Recombinant human insulin | Gibco | A11382II | Biostability studies |
Rheometer | TA Instruments | DHR-2 Rheometer | Rheological characterization |
Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516-5G | Biostability studies |