이 프로토콜은 주사용, 초분자 폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔 생체 재료의 합성 및 제형을 설명합니다. 약물 전달, 바이오 의약품 안정화 및 세포 캡슐화 및 납품을 위한 이러한 물질의 적용이 입증된다.
이러한 방법은 생체 재료로 사용하기 위해 주사용, 초분자 폴리머 나노 입자 (PNP) 하이드로겔을 공식화하는 방법을 설명합니다. PNP 하이드로겔은 동적, 다원적 상호 작용을 통해 비 공유 크로스 링커 역할을 하는 네트워크 폴리머및 자체 조립 코어 쉘 나노 입자로서 소수성 변형 셀룰로오스의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. 이러한 방법은 나노 침전을 통해 이러한 자체 조립 나노 입자의 형성뿐만 아니라 튜닝 가능한 기계적 특성으로 하이드로겔을 형성하기 위해 두 성분의 제형 및 혼합을 모두 설명합니다. 합성된 재료의 품질을 특성화하기 위해 다이나믹 광 산란(DLS) 및 유경학의 사용도 상세하다. 마지막으로, 약물 전달, 바이오 의약품 안정화 및 세포 캡슐화 및 전달을 위한 이러한 하이드로겔의 유용성은 약물 방출, 열 안정성 및 세포 정착 및 생존가능성을 특성화하기 위해 체외 실험을 통해 입증된다. 생체 적합성, 주사용 성 및 가벼운 젤 형성 조건으로 인해 이 하이드로겔 시스템은 다양한 생체 의학 응용 분야에 적합한 쉽게 튜닝할 수 있는 플랫폼입니다.
주사용 하이드로겔은 치료 세포와 약물을 대조된 방식으로 신체에 전달하는 새로운도구이다. 이러한 물질은 약물 이나 세포로 로드될 수 있으며 피상 조직에 직접 주입을 통해 또는 깊은 조직에 카테터 전달에 의해 최소 침습적 방식으로 투여 될 수있다. 일반적으로 주사용 하이드로겔은 일시적인 물리적 상호 작용에 의해 서로 연결되는 수분 부은 폴리머 네트워크로 구성됩니다. 나머지에서, 이러한 크로스 링크는 젤에 고체와 같은 구조를 제공하지만, 충분한 기계적 힘의 적용시 이러한 크로스 링크는 일시적으로 중단되어 물질을 쉽게2를흐를 수있는 액체와 같은 상태로 변환합니다. 이러한 유변학적 특성으로, 물루3시 작은 바늘 직경을 통해 물리적 하이드로겔이 얇게 전단되고 흐르는 것을 허용하는 것은 이러한 유변학적 특성이다. 주입 후, 재료 개혁의 중합체 네트워크는 자체 치유를 허용하고 신속하게 시투4,5에서고체와 같은 젤을 형성할 수 있게 한다. 이러한 구조는 조직재생6,7을위한 약물 또는 비계에 대한 느린 방출 창고역할을 할 수 있다. 이들 물질은 약물 전달 기술,재생 의학 및 면역공학1,8,9,10,11,12를포괄하는 다양한 응용 분야에서 사용되어 왔다.
천연 소재(예를 들어, 알기네이트 및 콜라겐) 및 합성 물질(예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 또는 이와 유사한 수성 중합체)는 생체 적합성 주사용 하이드로겔물질(13,14,15)으로개발되었다. 많은 천연 소재는 재현성4,16에영향을 미치는 배치 대 배치 변동을 나타낸다. 이러한 물질은 종종 온도에 민감한, 생리 온도에 도달 하 고 치료; 따라서 이러한 자료를 처리하는 것은 추가적인 기술적 및 물류 적 과제를야기한다(17). 합성 물질은 보다 정밀한 화학적 제어와 우수한 재현성을 허용하지만, 이러한 물질은 때때로 생체 적합성을 제한하는 불리한 면역 반응의 대상이 될 수 있으며, 생체 내 치료 응용 분야에서 중요한특징인 생체내 치료 응용6,18,19. 최근 연구에 따르면 기계적 특성 최적화, 폴리머 네트워크 메쉬 크기, 생리활성 분자 큐, 생분해성 및 물질의 면역원성을 포함한 주사용 하이드로겔 소재엔지니어링에 관여하는 많은 복잡한 설계 기준이 있는 것으로 나타났다(20,21,22,23,24,25, 26). 이러한 모든 요소는 관심의 적용에 따라 고려해야 하며, 이는 모듈식 화학적 튜닝 가능한 플랫폼이 광범위한 응용 프로그램을 만족시키는 데 이상적입니다.
본 방법은 튜닝 가능한 기계적 특성, 높은 생체 적합성 및 낮은 면역원성을 나타내는 주사용 폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔 플랫폼의 제형 및 사용을 설명하고, 생리활성 분자 큐27,28,29,30,31,32,33을결합하기 위한 부위를 제시한다. 이러한 PNP 수압겔은 수성 변형 셀룰로오스 폴리머및 폴리(에틸렌 글리콜)-블록 폴리(lacticacid) (PEG-PLA) (PEG-PLA)(27) 27,34로 구성된 자체 조립 코어 쉘 나노입자로 구성되어 있어 수분자 네트워크를 생성한다. 보다 구체적으로, 도데킬-변형 된 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스 폴리머(HPMC-C12)는이러한 나노입자 사이의 PEG-PLA 나노입자 및 교량의 표면과 동적으로 상호 작용하여 이 중합체네트워크(27,34)를형성한다. 이러한 동적, 다원 상호 작용을 통해 재료는 주입 중에 얇은 전단을 하고 투여 후 빠르게 자가 치유할 수 있습니다. PNP 하이드로겔 성분은 간단한 1냄비 반응을 통해 쉽게 제조되고 PNP 하이드로겔은 두성분(35)의간단한 혼합에 의해 온화한 조건하에서 형성된다. 제조의 용이성으로 인해 이 하이드로겔 플랫폼은 스케일에서 매우 확장성이 높습니다. PNP 하이드로겔의 기계적 특성 및 메쉬 크기는 제형에서 폴리머 및 나노입자 성분의 중량 퍼센트를 변경하여 제어됩니다. 이 플랫폼을 가진 사전 연구는 PNP 하이드로겔이 생체 적합성이 높고 생분해성 및 비면역원성28,30,31임을나타낸다. 전반적으로, 이 하이드로겔은 수술 후 접착 방지, 조직 공학 및 재생, 지속적인 약물 전달 및 면역 공학을 포괄하는 생물 의학 응용 분야에서 광범위한 유틸리티를 제시합니다.
폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔은 직접 주입 또는 카테터 전달을 통해 최소 침습 적 투여를 통해 치료 세포 및 약물의 장기 국소 전달을 용이하게 제조하고 가능하게 한다. 이러한 프로토콜은 PNP 하이드로겔의 제형과 결과 물질의 품질을 보장하기 위한 특성화 방법을 설명합니다. 수퍼컬분자 PNP 하이드로겔은 제조할 수 있으며 변형된 셀룰로오스 폴리머 및 폴리머 코어 쉘 나노입자의 간단한 혼합을 통해 형성된다. 본 방법은 간단한 팔꿈치 혼합 프로토콜을 통해 주사기에 미리 로드된 젤을 형성하는 촉진 절차를 설명합니다. DLS와 같은 각 부품의 품질 관리 메트릭을 통해 NP 크기 및 분포를 모니터링할 수 있으며, 일관된 유변학적 특성으로 PNP 하이드로겔 재료를 재현가능하게 제조할 수 있습니다. HPMC-C12 또는 NP의 양을 다양하게 하여 결과 PNP 하이드로겔의 메쉬 크기와 강성을 조절할 수 있습니다. 이러한 특성은 특정 생체 의학 응용 분야에 가장 잘 맞게 조정할 수 있으며, 여기에 자세히 설명된 유변학적 방법으로 연구자들은 PNP 하이드로겔의 전단 숱이 및 자가 치유 특성을 특성화하여 특정 응용 분야에 대한 플랫폼을 최적화할 수 있습니다. 체외 방출 연구를 위한 방법 또한 설명 됩니다.; 연구원은 이러한 연구를 사용 하 여 관심 있는 약물의 출시의 상대적인 기간을 특성화 하는 데 사용할 수 있습니다., 생체 내 연구에서 미래를 알리는. 안정성 연구를 사용하여 연구원은 또한 생체 치료제의 콜드 체인 의존성을 줄이기 위한 강력한 잠재적 응용 프로그램과 함께, 시간이 지남에 따라 민감한 생물 치료제의 생물학적 구조와 안정성을 보존하는 데 도움이 이러한 물질의 능력을 평가할 수 있습니다. 마지막으로, 간단한 세포 생존 가능성 분석으로, 세포 성장 및 PNP 물질 내의 이주를 평가할 수 있습니다, 세포 치료 및 발판에 있는 잠재적인 응용으로.
우리 그룹은 PNP 하이드로겔 플랫폼27에대한 많은 강력한 응용 프로그램을 발견했다. PNP 하이드로겔은 아체유닛 백신의 느린 전달을 위해 사용되어, 항원 및 보조제의 매칭 된 운동 방출 프로파일을 가능하게하여 유머 면역 반응(31)의크기, 지속 시간 및 품질을 향상시킵니다. PNP 하이드로겔은 가장 일반적으로 사용되는 하이드로겔보다 메쉬 크기가 더 작은 것으로 나타났기 때문에 확산을 늦추고 분자 화물을 천천히 방출하는 데 효과적입니다. PNP 하이드로겔의 독특한 조직 부착 특성 및 기계적 특성은 수술 후 장기의 넓은 표면 영역에 하이드로겔을 분사하여 수술로 인한 접착을 방지하기 위해 물리적 장벽을 형성하는 데활용되었다(30) PNP 하이드로겔은 또한 효과적인 세포 전달 차량으로 나타났으며, 기계적 특성은 실제로 주입 시 주사기 바늘에서 발생하는 기계적 힘으로부터 세포를 보호하여 셀생존가능성을향상시키는 것으로 나타났다. NPs가 세포 접착제 펩티드와 결합될 때, 세포는 PNP 매트릭스를 부착하고 관여하여 실행 가능한 상태를 유지할 수 있다. 이러한 접근법을 이용하여, PNP 하이드로겔은 액체차량(28)을이용한 방법에 비해 주입된 줄기세포의 국소 보존을 개선하는 것으로 나타났다. 또한, PNP 하이드로겔은 가혹한 응력 노화 조건 하에서도 캡슐화된 인슐린의 열유도 응집을 방지하는 것으로 나타났으며, 이러한 물질이 온도에 민감한약물(38)을냉장할 필요성을 줄일 수 있음을 시사한다.
전반적으로, 여기에 설명된 방법론은 연구 그룹이 생물 재료로 PNP 하이드로겔을 제조하고 탐구할 수 있게 해 줄 것이다. 이러한 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 연구를 모두 추구하기에 충분한 하이드로겔 물질을 제조하기 위한 실험실 규모의 합성 기술을 제공합니다. 위에서 설명한 연구는 이러한 물질의 동적 교차링크가 분자 화물의 수동 확산을 제한하면서 갇힌 세포의 활성 운동성을 허용함으로써 다양한 생체 의학 응용 분야에 적합할 수 있음을 나타냅니다. 연구원은 PNP 플랫폼이 통제된 약 납품을 통해 임상 결과를 향상하고 세포 모집 및 기계생물학과 같은 기본적인 생물학 기계장치를 공부하기 위하여 접근가능하고 강력한 공구를 찾아냅니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 빌 & 멜린다 게이츠 재단 (OPP1113682)과 빌 & 멜린다 게이츠 재단 (OPP12111043)과 인간 시스템 면역학 센터에 의해 재정적으로 지원되었다. C.M.M. 스탠포드 대학원 펠로우십과 스탠포드 바이오-X 윌리엄과 린다 스티어 펠로우십의 지원을 받았습니다. A.K.G.는 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십과 스탠포드 대학원 과학 및 공학 펠로우십의 가빌란 펠로우십에 감사드립니다. S.C. 수상 번호 F32CA247352에서 건강의 국립 연구소의 국립 암 연구소에 의해 지원되었다. 저자는 또한 닥터 길리 로스, 닥터 앤서니 유, 린지 스테이플턴 박사, 헥터 로페즈 에르난데스 박사, 안드레아 다퀴노 박사, 줄리 베일렛, 셀린 라이온, 벤 우, 에밀리 메니, 에밀리 게일 박사, 안톤 스미스 박사를 포함한 Appel Lab 회원들이 이러한 프로토콜을 개발하는 데 도움을 준 노력과 시간을 따뜻하게 인정하고 싶습니다.
21G needles | BD | 305165 | PNP hydrogel injection |
22G, 4 in hypodermic needles | Air-Tite | N224 | In vitro release studies |
384-well plates, black, clear bottom | Corning | 3540 | Dynamic light scattering (DLS) |
96-well plates, black | Fisher Scientific | 07-200-627 | Biostability studies |
96-well plates, clear | Corning | 3599 | Cell viability and settling studies |
Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Cell viability and settling studies |
Capillary tubes | McMaster-Carr | 8729K66 | In vitro release studies |
Centrifugal filter units | Fisher Scientific | UFC901024 | NP concentration |
Cuvettes | Millipore Sigma | BR759015-100EA | Cell viability and settling studies |
DLS Plate Reader | Wyatt Technology | DynaPro II Plate Reader | Dynamic light scattering (DLS) |
Epoxy | VWR International | 300007-392 (EA) | In vitro release studies |
Hypodermic needles | Air-Tite | 8300015027 | In vitro release studies |
Luer elbow connector | Cole-Parmer | EW-30800-12 | PNP hydrogel formulation |
Luer lock syringe | Fisher Scientific | 14-955-456 | PNP hydrogel formulation |
Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher Scientific | 10010049 | PNP hydrogel formulation |
Plastic Spatula | Thomas Scientific | 1229F13 | Rheological characterization |
Plate Reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader | Biostability studies |
Plate seals | Excel Scientific | TS-RT2-100 | Biostability studies |
Recombinant human insulin | Gibco | A11382II | Biostability studies |
Rheometer | TA Instruments | DHR-2 Rheometer | Rheological characterization |
Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516-5G | Biostability studies |