Attivazione 3D dell'intero cervello e mappatura della connettività funzionale nei topi utilizzando l'imaging ecografico funzionale transcraniale

Summary

Questo protocollo descrive la quantificazione delle variazioni emodinamiche cerebrali volumetriche nel cervello del topo utilizzando l’ecografia funzionale (fUS). Le procedure per la mappa di attivazione funzionale 3D dopo la stimolazione sensoriale e la connettività funzionale dello stato di riposo sono fornite come esempi illustrativi, in topi anestetizzati e svegli.

Abstract

L’imaging a ultrasuoni funzionali (fUS) è una nuova modalità di imaging cerebrale che si basa sulla misura ad alta sensibilità del volume di sangue cerebrale raggiunta dall’angiografia doppler ultraveloce. Poiché la perfusione cerebrale è fortemente legata all’attività neuronale locale, questa tecnica consente la mappatura 3D dell’intero cervello dell’attivazione regionale indotta dal compito e la connettività funzionale dello stato di riposo, in modo non invasivo, con una risoluzione spazio-temporale senza pari e semplicità operativa. Rispetto alla fMRI (risonanza magnetica funzionale), uno dei principali vantaggi dell’imaging fUS consiste nel consentire una completa compatibilità con gli esperimenti sugli animali svegli e comportati. Inoltre, la mappatura cerebrale fMRI nei topi, il modello preclinico più utilizzato nelle Neuroscienze, rimane tecnicamente impegnativa a causa delle piccole dimensioni del cervello e della difficoltà di mantenere condizioni fisiologiche stabili. Qui presentiamo un protocollo semplice, affidabile e robusto per l’imaging fUS dell’intero cervello in topi anestetizzati e svegli utilizzando un sistema fUS commerciale pronto all’uso con un trasduttore lineare motorizzato, che produce una significativa attivazione corticale dopo la stimolazione sensoriale e un modello di connettività funzionale 3D riproducibile per l’identificazione della rete.

Introduction

Negli ultimi due decenni, il neuroimaging è diventato uno strumento importante per studiare la funzione e l’organizzazione del cervello, consentendo ai ricercatori di fare importanti scoperte nel campo delle neuroscienze. Oggi, la risonanza magnetica funzionale (fMRI) è diventata la tecnica di neuroimaging clinico gold standard per valutare l’attivazione cerebrale evocata da compiti o farmaci e per mappare la connettività funzionale a riposo. Mentre la fMRI umana ha un’elevata affidabilità e sensibilità, la fMRI del mouse rimane tecnicamente impegnativa per numerose ragioni¹. In primo luogo, la fMRI ha una scarsa risoluzione spaziale e temporale. Le piccole dimensioni del cervello del topo richiedono l’uso di forti campi magnetici utilizzando costosi scanner per ottenere una risoluzione spaziale ragionevole. In secondo luogo, mantenere parametri fisiologici stabili all’interno della gamma ristretta che consente un efficiente accoppiamento neuro-vascolare è molto difficile nei topi anestetizzati. Infine, il segnale dipendente dal livello di ossigeno nel sangue (BOLD) su cui si basano gli studi fMRI ha una sensibilità relativamente scarsa, che porta a un basso rapporto segnale-rumore quando applicato ai topi e spesso richiede una presentazione ripetuta dello stimolo su una lunga acquisizione per rilevare piccole variazioni. Essendo il topo il modello animale più utilizzato nella ricerca preclinica biomedica, queste limitazioni sono in parte responsabili del divario traslazionale nella neuropsichiatria, impedendo la trasposizione di nuovi promettenti bersagli terapeutici sul banco in trattamenti efficaci al capezzale.

L’ecografia funzionale (fUS) è una tecnica di neuroimaging di recente sviluppo basata sul doppler ultraveloce². Campionando direttamente il volume del sangue cerebrale, questa tecnica consente di sondare l’attività cerebrale in tempo reale attraverso l’accoppiamento neurovascolare. Rispetto ad altre tecniche di neuroimaging, fUS produce una risoluzione spaziale di 100 μm e una risoluzione temporale nelle decine di millisecondi. Questa tecnica consente l’imaging dell’intero cervello di sezioni coronali complete del cervello del topo, completamente non invasivamente. Inoltre, è pienamente compatibile con animali coscienti e che si comportano^3,4,5. Una delle principali limitazioni attuali di fUS è la sua funzione 2D, che consente di registrare un singolo piano coronale allo stesso tempo. Mentre la fUS volumetrica 3D che utilizza trasduttori array a matrice di matrice 2D è già stata dimostrata con successo nei ratti⁶ e confermata nei topi^7,la sua attuale mancanza di sensibilità richiede una craniotomia completa e una media di un numero importante di studi per rilevare un leggero cambiamento di attività. In alternativa, i trasduttori lineari possono essere calpestati in più posizioni ed eseguire l’imaging funzionale piano per piano per coprire l’intero cervello. Tuttavia, questa tecnica richiede numerose ripetizioni del paradigma sperimentale e come tali lunghi tempi di acquisizione (3-4 ore per il cervello del topo)^8,9.

Nel presente lavoro, descriviamo una solida piattaforma sperimentale che include uno scanner ad ultrasuoni funzionale disponibile in commercio e un trasduttore lineare a commutazione di piano veloce con procedure per acquisire dati fUS 3D in topi anestetizzati e svegli, consentendo la mappatura funzionale volumetrica e transcraziale del cervello del topo, in modo non invasivo, senza mezzo di contrasto e in brevi tempi di acquisizione. Illustriamo questa caratteristica mappando l’attivazione della corteccia somatosensoriale dopo la stimolazione dei baffi e la connettività funzionale dello stato di riposo. Oltre alla preparazione degli animali e alla raccolta dei dati, descriviamo anche la procedura per la visualizzazione, la registrazione dell’atlante e l’analisi dei segnali fUS in tempo reale.

Protocol

Tutte le procedure qui presentate sono state eseguite in accordo con la direttiva del Consiglio della Comunità europea del 22 settembre 2010 (010/63/UE) e il nostro comitato etico locale (Comité d’éthique en matière d’expérimentation animale number 59, ‘Paris Centre et Sud’, progetto #2017-23). I topi adulti (maschio C57BL/6 Rj, età 2-3 mesi, 20-30 g, di Janvier Labs, Francia) sono stati alloggiati 4 per gabbia con un ciclo luce/buio di 12 ore, temperatura costante a 22 °C e cibo e acqua ad libitum. Prima dell’inizio degli esperimenti, agli animali viene dato un periodo minimo di acclimatazione di una settimana alle condizioni abitative. 1. Preparazione animale per l’imaging fUS anestetizzato Anestesia Pesare il mouse. Preparare una miscela di ketamina e xilazina a 10 mg/mL e 2 mg/mL, rispettivamente, in soluzione salina sterile. Somministrare 0,2 mL della soluzione di ketamina/xilazina per via intraperitoneale utilizzando un ago calibro 26 e una siringa monouso da 1 mL. Dopo alcuni minuti, posiziona l’animale sulla cornice stereotassica, assicurandoti che la testa sia piatta. Somministrare un secondo volume di anestetici per raggiungere una dose totale di 100 mg/kg di ketamina e 20 mg/kg di xilazina (tenendo conto della dose iniziale).NOTA: l’anestesia dovrebbe durare per 1 ora. Per mantenere una sedazione costante per un tempo più lungo, iniettare 0,05 mL della miscela ketamina/xilazina ogni 30 minuti per via intraperitoneale. Preparazione animale per la sessione di imaging anestetizzato Applicare un unguento per gli occhi (ad esempio, Ocry-Gel) sugli occhi del topo per evitare qualsiasi formazione di cataratta durante la sessione di imaging. Rasare la testa del mouse usando un trimmer. Applicare un po’ di crema depilatoria e risciacquare dopo un paio di minuti. Ripetere fino a quando i capelli sono completamente rimossi. Inserire perni sottocutanei negli arti per la registrazione dell’elettrocardiogramma (ECG). Posizionare il gel ad ultrasuoni centrifugato (1500 rpm, 5 min) sulla testa. Monitorare la profondità dell’anestesia durante l’intera durata degli esperimenti (induzione dell’anestesia inclusa). Mantenere la temperatura degli animali a 37 °C utilizzando una coperta riscaldante accoppiata a una sonda rettale. Monitorare i seguenti parametri fisiologici che sono indicatori indiretti della profondità dell’anestesia: Frequenza cardiaca (220-250 battiti al minuto – monitorati attraverso elettrodi sottili dell’elettrocardiogramma impiantati per via sottocutanea) e Frequenza respiratoria (130-140 respiri al minuto – monitorata tramite uno spirometro collegato al sistema di acquisizione ECG).NOTA: una descrizione dell’impostazione sperimentale è illustrata nella Figura 1. Figura 1: Configurazione sperimentale per esperimenti fUS anestetizzati. Descrizione della configurazione sperimentale che mostra tutte le attrezzature scientifiche necessarie durante un esperimento anestetizzato. 1. Monitoraggio fisiologico: visualizzazione in tempo reale delle frequenze respiratorie e cardiache. 2. Modulo motore a quattro assi (tre traslazioni e una rotazione) monitorato dal sistema Iconeus One(9)e che consente di eseguire scansioni tomografiche 3D transcraniali o acquisizioni 4D. 3a. Servomotore che aziona lo stimolatore del baffo (3b.) Il servomotore è controllato da una scheda arduino uno che è interfacciata con il sistema Iconeus One (9) al fine di sincronizzare i modelli di stimolazione con le sequenze di imaging. 4.a. Regolatore della pompa a siringa. 4.b. Porta siringhe. 5.a. Monitor della piastra di temperatura che controlla la piastra riscaldante. 5.b. Piastra riscaldante e termometro rettale interfacciati con il monitor della piastra di temperatura (5.a.). 6. Gel ad ultrasuoni posto tra la testa dell’animale e la sonda ad ultrasuoni, fornendo accoppiamento acustico tra di loro. 7. Sonda ad ultrasuoni da 15 MHz. 8. Portasonde che collega la sonda (7) al modulo motore (2). 9. Iconeus One apparecchiature e software, che consentono di programmare diverse sequenze di imaging e controllare il modulo motori (2) che aziona la sonda (7). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 2. Preparazione animale per esperimenti di topi fissi a testa sveglia Chirurgia della piastra frontale Posizionare l’animale anestetizzato (gradini 1.1-1.2) nel telaio stereotassico su una piastra riscaldante (37 °C). Applicare gel protettivo per gli occhi e somministrare lidocaina s.c. (0,2 ml, 2 %) sotto la pelle del cuoio capelluto utilizzando un ago calibro 26 e attendere alcuni minuti.NOTA: Monitorare il livello di anestesia ogni 10-30 minuti in risposta (assenza di) a un pizzico di dita fermo. Eseguire un’incisione che segue la sutura sagittale da dietro l’osso occipitale fino all’inizio dell’osso nasale. Usando le forbici chirurgiche, asportare la pelle su entrambi gli emisferi. Pulire il cranio con una soluzione di iodio all’1% e rimuovere il periosteo rimanente. Utilizzando la piastra di testa come modello, praticare due fori (diametro 1 mm) nel cranio per posizionare le viti di ancoraggio.ATTENZIONE: Fare attenzione a non perforare completamente il cranio per evitare danni cerebrali o infiammazione duratura Posizionare la piastra frontale con le viti. Utilizzare cemento dentale per fissare le viti e la piastra frontale nella parte anteriore e posteriore del telaio per mantenere una buona presa dell’impianto.ATTENZIONE: Fare attenzione a non applicare cemento all’interno della finestra del telaio in quanto diminuisce notevolmente la qualità del segnale. Coprire il cranio con un sottile strato di colla chirurgica per proteggere l’osso e sigillare le ferite sul lato della finestra di imaging. Rimuovere l’animale dal telaio stereotassico dopo che il cemento è asciutto e invertire l’anestesia con un’iniezione sottocutanea di atipamezolo a 1 mg / kg. Una somministrazione profilattica di meloxicam (5 mg/kg/die, s.c.) viene somministrata per il dolore post-operatorio. Mettere l’animale in una gabbia di recupero su una piastra riscaldante (37 °C). Il topo può restituire la sua gabbia di casa con i compagni di cucciolata entro poche ore. Posizionare un cappuccio magnetico stampato in 3D (materiale in acido poliattico con inserti magnetici) sopra la piastra per la protezione (Figura 2A). Lasciare il mouse per recuperare da 4 a 6 giorni prima dell’inizio dell’assuefazione alla gabbia della casa mobile (MHC).NOTA: Il peso totale del cappuccio e della piastra è di 2,8 g. Manipolazione e assuefazione Il giorno 1 post-recupero (PR), tenere delicatamente il mouse in mano per 5-10 minuti più volte al giorno. Il giorno 2 PR, ripetere la manipolazione come nel giorno 1 e lasciare l’animale per 5-10 minuti esplorando liberamente MHC.NOTA: riprodurre musica di sottofondo nella stanza può aiutare a ridurre lo stress degli animali. Il giorno 3 PR, lascia che l’animale esplori liberamente l’MHC per 5-10 minuti. Successivamente, afferrare con cura la piastra frontale e posizionarla delicatamente nel morsetto, spostando manualmente la gabbia di carbonio per accompagnare il mouse. Abituare l’animale in posizione fissa per 5-10 minuti. Pulire l’MHC tra una sessione di allenamento e l’altra con una soluzione di etanolo al 70% e risciacquare con acqua di rubinetto.NOTA: Assicurarsi che l’MHC riceva un flusso d’aria sufficiente come raccomandato dal produttore. L’altezza del morsetto della testa deve essere regolata manualmente per fornire una posizione comoda. Nei giorni 4 e 5 PR, bloccare ripetutamente l’MHC del mouse e aumentare gradualmente il tempo di fissaggio della testa, a partire da 5 minuti e fino a 30 minuti. Applicare un po ‘di gel salino e ultrasuoni sulla finestra di imaging per abituarsi. Il giorno 6 PR, ripetere il protocollo dal giorno 4/5 PR e posizionare la sonda sopra la testa dell’animale seguendo il passaggio 3.1. Il giorno dell’esperimento, procedere come descritto sopra. Quindi, umidificare la finestra di imaging con soluzione salina e applicare un po ‘di gel ad ultrasuoni. Inizia il tracciamento dell’animale e procedi al posizionamento della sonda (vedi sotto).NOTA: il bloccaggio nell’MHC può anche essere fatto avvolgendo il mouse in uno straccio. In tal caso, i topi devono essere abitati alla procedura di avvolgimento prima della fissazione della testa. Una descrizione di una configurazione sperimentale completa per l’imaging sveglio è fornita nella Figura 2B. Figura 2: Configurazione sperimentale per esperimenti fUS svegli. Un. Illustrazione schematica della copertura magnetica della piastra di testa che protegge la finestra di imaging (creata con BioRender.com). Durante le sessioni di imaging (a sinistra), il coperchio viene rimosso per scansionare il cervello nella grande apertura offerta dalla piastra della testa. B. Fotografia della configurazione sperimentale per l’imaging transcraniale da sveglio in topi che si comportano liberamente con la testa. 1. Sistema e software Iconeus One, che consente di impostare diverse sequenze di imaging e controllare il modulo motori. 2. Modulo motori a quattro assi (tre traslazioni e una rotazione) monitorato dal sistema Iconeus One (1) e che consente scansioni tomografiche 3D o acquisizioni 4D. 3. Tavolo di erogazione dell’aria. 4. Gabbia per case mobili (MHC). 5a,5b. Fotografie che mostrano viste più ravvicinate dell’ambiente dell’animale all’interno dell’MHC. 6. Sistema di fissaggio della testa che blocca la piastra della testa. 7. Portasonde che collega la sonda al modulo motore (2). Sonda ad ultrasuoni da 8.15 MHz. 9. Gel ad ultrasuoni posto tra la testa del mouse e la sonda ad ultrasuoni, fornendo accoppiamento acustico tra di loro. 10. Servomotore che aziona lo stimolatore del baffo. Il Servomotore è controllato da una scheda Arduino Uno che viene interfacciata con il sistema Iconeus One tramite segnale TTL (1) al fine di sincronizzare i pattern di stimolazione con le sequenze di imaging. C. Illustrazione delle diverse possibilità di campionamento spaziale (create con BioRender.com): in ogni caso, la sonda viene portata dalla prima all’ultima posizione e viene registrata un’immagine Doppler in ogni posizione per ricostruire il volume impilato. Questo processo viene continuamente ripetuto durante l’intero tempo di acquisizione. Scansione densa (a sinistra): il passo tra le fette deve essere abbastanza piccolo (in genere 400 μm, che corrisponde alla risoluzione di elevazione) per consentire l’imaging volumetrico. Sparse Scan (a destra): se sono mirate regioni funzionali distanti (in posizioni diverse), è anche possibile diminuire il campionamento spaziale per immaginare diverse fette che intersecano queste regioni senza compromettere il campionamento temporale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 3. Posizionamento della sonda Avviare il software (ad esempio, IcoScan) e creare una sessione di esperimento. Vai al menu Sposta sonda per regolare la posizione della sonda a ultrasuoni utilizzando la tastiera di navigazione.NOTA: la sonda deve essere posizionata a circa 1 mm sopra la testa dell’animale. È fondamentale assicurarsi che la sonda sia a contatto con il gel ad ultrasuoni prima di iniziare qualsiasi sequenza di imaging. Avviare l’acquisizione Live View e regolare la posizione della sonda, se necessario, tramite l’imaging in tempo reale del CBV animale (volume del sangue cerebrale). Allineare il cervello al centro dell’immagine. Ottimizza i parametri di imaging per acquisire il più alto rapporto segnale-rumore.NOTA: Negli esperimenti sui topi svegli, la dimensione dell’apertura deve essere ridotta per evitare artefatti indotti dalla contrazione dei muscoli laterali. 4. Scansione angiografica e registrazione dell’atlante Aprire l’opzione Angio 3D nel software di acquisizione. Sul pannello preimpostato, regolare i parametri di scansione (prima fetta, ultima fetta e dimensione del passo) per scansionare l’intero cervello(Figura 3A,B)e avviare l’acquisizione.NOTA: quando si impostano i parametri di scansione, assicurarsi che la scansione copra la parte posteriore del cervello Lasciare aperto il software di acquisizione e avviare il software per l’analisi e la visualizzazione dei dati (ad esempio, IcoStudio) e caricare la scansione angio 3D. Navigare attraverso il volume di acquisizione utilizzando il pannello a 3 viste e selezionare la Direzione scansione coronale: antero-posteriore o postero-anteriore. Vai al pannello di registrazione del cervello. Caricare il modello di riferimento del mouse che sarà necessario per il processo di registrazione. Registrare la scansione su Allen Mouse Common Coordinates Framework utilizzando la modalità di registrazione completamente automatica o manuale ( Figura3C). Controllare il risultato osservando la sovrapposizione della scansione angio 3D e del modello di riferimento o osservando la sovrapposizione della scansione e dell’atlante di riferimento di Allen utilizzando il pannello Atlas Manager (Figura 3D). Salvare la registrazione come file con estensione bps.NOTA: il file di registrazione può essere riutilizzato per qualsiasi altra acquisizione eseguita durante la stessa sessione di esperimento. 5. Sistema di posizionamento del cervello (BPS) Nel software IcoStudio, assicurarsi che la scansione angiografica e il relativo file .bps (generato nel passaggio 4.4) siano caricati. Vai al pannello di navigazione del cervello. Nel pannello Atlas Manager, navigate attraverso l’atlante cerebrale a brughino del mouse con il navigatore dell’albero padre/figlio. Trova le regioni anatomiche mirate e selezionale per sovrapporle alla tua scansione nelle 3 viste. Visualizzate le regioni di destinazione nel pannello a 3 view e scegliete un piano di imaging che si sovrapponga alle regioni di destinazione per l’esperimento. Per fare ciò, impostare manualmente due marcatori sulla posizione coronale che include le regioni di interesse. Fare clic su Brain Positioning System (BPS) per estrarre le coordinate motorie risultanti. Queste coordinate corrispondono alla posizione della sonda che consente di visualizzare il piano di destinazione. Controllare l’anteprima dell’immagine che viene calcolata dall’angio scansione. Nel software IcoScan, accedere al pannello di posizionamento della sonda e fare clic su Inserisci coordinate BPS. Applicare le coordinate indicate nel passaggio 5.4. La sonda si muove e si allinea sul piano di imaging mirato. Eseguire un’acquisizione live view e verificare che il piano di imaging corrente corrisponda alla previsione fornita nel passaggio 5.4.NOTA: È anche possibile selezionare piani parasagittali/non ortogonali. Figura 3: Scansione angiografica transcraniale veloce e registrazione cerebrale per un posizionamento preciso della sonda. Un. Rappresentazione schematica del cervello del topo scansionato transcranicamente dalla sonda ultrasonica dalla prima fetta coronale (verde) all’ultima fetta coronale (blu) durante una scansione angiografica veloce. L’attuale fetta tagliata (rappresentata in rosso) si muove passo dopo passo dalla parte posteriore (verde) alla parte anteriore (blu) del cervello. Creato con BioRender.com B. Screenshot del software di acquisizione IcoScan nel pannello Angio 3D. I parametri preimpostati a destra configurano la scansione veloce. Le posizioni in mm della prima fetta, dell’ultima fetta e della dimensione del gradino devono essere ben scelte per scansionare linearmente l’intero cervello. C. Screenshot del software di elaborazione IcoStudio. La scansione angio 3D veloce viene automaticamente registrata in un modello di riferimento del cervello del topo. Le tre viste (a sinistra) mostrano la sovrapposizione della vascolarizzazione e dell’atlante di Allen del cervello di topo nelle viste coronale, sagittale e assiale. D. Lay-out lineare (montaggio) di 16 fette (su 31) dall’angiografia 3D, con l’atlante di riferimento Di Allen registrato sovrapposto alla vascolarizzazione. E. Screenshot del pannello Brain Navigation che mostra il piano di imaging previsto corrispondente alle coordinate motorie calcolate dal software grazie ai due marcatori posti al centro della corteccia somatosensoriale primaria sinistra e destra, regione dei campi del barile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 6. Esperimento evocato dal compito: stimolazione dei baffi Predefinire la sequenza di stimolazione, incluso il tempo di stimolazione, il tempo di interstimolazione e il numero di ripetizioni. Esegui una sequenza fUS 3D definendo il tempo totale di acquisizione, il numero di posizioni e il tempo morto tra le posizioni. In caso di stimolazione automatica sincronizzata con il sistema di acquisizione tramite ingresso TTL, selezionare l’opzione Trig-IN prima di iniziare l’acquisizione.NOTA: Per i risultati presentati in questo lavoro, la stimolazione è stata erogata utilizzando un batuffolo di cotone posizionato in modo tale da consentire la deflessione della maggior parte dei baffi in direzione dorsale/ventrale. Era fissato su un servomotore azionato da una scheda Arduino UNO, collegata al sistema Iconeus One per garantire la sincronizzazione. I parametri consigliati per la stimolazione sono 30 s ON, 30 s OFF, ampiezza di 20° e frequenza 4 Hz. In alternativa, la stimolazione può anche essere erogata manualmente deviando i baffi nei momenti definiti durante l’acquisizione. Aprire l’acquisizione nel software IcoStudio ed entrare nel menu Mappa di attivazione. Compilare il campo del modello di attivazione con gli orari di inizio e fine e calcolare la mappa di attivazione. Regolare i parametri di visualizzazione per la visualizzazione. Esportare la mappa di attivazione come file .h5 per l’analisi off-line.NOTA: l’attivazione viene stimata utilizzando un approccio GLM (Generalized Linear Model) con lo stimolo coinvolto da una risposta emodinamica predefinita del mouse (HRF). In alternativa, l’attivazione può essere visualizzata direttamente stimando la correlazione di Pearson tra il modello di stimolazione e il segnale emodinamico di ciascun voxel. 7. Connettività funzionale 4D Esegui una sequenza fUS 3D definendo il tempo totale di acquisizione, il numero di posizioni del piano di imaging e il tempo morto tra le posizioni.NOTA: per la connettività funzionale 4D, si consiglia il tempo di acquisizione tra ogni volume 180). Salva l’acquisizione e caricala nel software IcoStudio. Se necessario, caricare il file .bps e il framework delle coordinate cerebrali del topo Allen. Nel gestore Atlas, selezionare le regioni dell’atlante come regioni di interesse (ROI). Accedere al menu Connettività funzionale e selezionare le regioni desiderate nel ROI manager. Visualizza i risultati come matrice di connettività (analisi supervisionata) o mappa di correlazione basata su seed (non supervisionata). Selezionare e regolare i filtri della larghezza di banda come desiderato ed esportare i risultati di correlazione per l’analisi statistica.NOTA: in modalità di imaging 3D fUS, le posizioni relative della sonda vengono impostate manualmente. Quindi, sono possibili due tipi di scansioni e possono essere scelti a seconda dell’applicazione funzionale: scansioni dense contro scansioni sparse (Figura 2C).

Representative Results

Questo protocollo descrive la quantificazione 3D delle variazioni emodinamiche cerebrali transcranicamente nel cervello del topo, a riposo o in risposta alla stimolazione sensoriale. La stimolazione dei baffi, un paradigma standard per mappare l’attivazione funzionale del cervello nei roditori, è stata selezionata come esempio di risposta evocata dalla stimolazione sensoriale. La Figura 4 mostra una mappa di attivazione rappresentativa in risposta alla stimolazione meccanica dei baffi in un topo anestetizzato ottenuta utilizzando l’imaging fUS transcranico. Il tempo totale di prova è stato di 760 s, con un basale di 60 s (prima e dopo la stimolazione), una stimolazione di 80 s e un tempo di recupero di 60 s, ripetuto 5x. L’attivazione significativa è stata determinata con la risoluzione di un modello lineare generale (GLM) utilizzando una funzione di risposta emodinamica del mouse predefinita (HRF). Le regioni attivate (punteggi Z con valore p >0,0000006 dopo una rigorosa correzione bonferroni per il confronto multiplo) vengono visualizzate come valori codificati a colori sovrapposti al modello del framework di coordinate comuni di Allen. Il decorso temporale voxel-saggio della corteccia somatosensoriale primaria controlaterale, regione del campo della botte (S1BF) ha rivelato un aumento del 15-20% del CBV rispetto al basale. Figura 4: Attivazione transcranica Mappe e decorso temporale rCBV dopo stimolazione dei baffi in topo anestetizzato ketamina/xilazina. Un. Mappa di attivazione che mostra i voxel significativamente attivati a seguito di stimolazione meccanica dei baffi destri (80 s ON, 60 s OFF, 5x) in anestesia ketamina/xilazina. Le mappe sono state ottenute calcolando i punteggi Z basati sull’analisi generale del modello lineare (GLM) con correzione Bonferroni per il confronto multiplo. I punteggi Z (codificati a colori) sono sovrapposti al modello 3D del cervello di Allen (dopo la registrazione con il sistema di posizionamento del cervello) e visualizzati in tre viste: coronale (a sinistra), sagittale (al centro) e assiale (a destra). Le regioni anatomiche del quadro di coordinate comuni del cervello del topo allen vengono visualizzate come riferimento. I voxel attivati sono ben posizionati all’interno della corteccia S1BF sinistra. Barra scala: 1 mm. Ogni volume di campione è stato scansionato su 2,8 mm (corrispondenti a 7 fette nella direzione di elevazione) in 3,85 s consentendo di registrare 20 campioni volumici durante ogni risposta funzionale. B. Rendering 3D dell’aumento del volume del sangue cerebrale relativo evocato dalla stimolazione dei baffi (rCBV) rispetto al livello basale. La delineazione anatomica dell’S1BF è indicata in blu. C. Corso temporale delle variazioni CBV nel sinistro S1BF (blu) e lo stimolo corrispondente applicato (rosso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Lo stesso paradigma è stato applicato in un mouse che si comporta a testa fissa nella casa mobile utilizzando il preset sveglio di IcoScan. La Figura 5 presenta la mappa di attivazione dopo un esperimento di stimolazione multipla dei baffi utilizzando la configurazione sperimentale descritta nella Figura 2. Alcuni baffi posteriori e caudali sono stati stimolati con il seguente schema: 30 s basali seguiti da cinque prove consecutive di 30 s ON (4 Hz) e 30 s OFF (Figura 5C). La stimolazione è stata erogata utilizzando un servomotore azionato da una scheda Arduino UNO che attiva la sequenza di acquisizione delle immagini per la sincronizzazione. L’attivazione significativa è stata determinata con la risoluzione di un modello lineare generale (GLM) utilizzando una funzione di risposta emodinamica del mouse predefinita (HRF). La correzione del confronto multiplo è stata eseguita con il metodo Bonferroni. Il livello alfa convenzionale di 0,05 è stato normalizzato dal numero totale di voxel nel volume di acquisizione, con una soglia finale rigorosa di 0,000003. Figura 5: Mappe di attivazione e decorso temporale rCBV dopo stimolazione dei baffi nel topo che si comporta da sveglio. Un. Mappa di attivazione che mostra i voxel significativamente attivati a seguito della stimolazione meccanica dei baffi giusti (30 s ON, 30 s OFF, 5x) in un mouse sveglio nella forca mobile. Le mappe sono state ottenute calcolando I punteggi Z basati sull’analisi generale del modello lineare (GLM) con correzione di Bonferroni per il confronto multiplo (normalizzazione per il numero totale di voxel). I punteggi Z (codificati a colori) sono sovrapposti al modello 3D del cervello di Allen (dopo la registrazione con il Brain Positioning System) e visualizzati in tre viste: coronale (a sinistra), sagittale (al centro) e assiale (a destra). Le regioni anatomiche dell’Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework vengono visualizzate come riferimento. I voxel attivati sono ben posizionati all’interno della corteccia S1BF sinistra. Barre di bilancia, 1 mm. Ogni volume del campione è stato scansionato su 1,6 mm (corrispondenti a 3 fette nella direzione di elevazione) in 3,85 s consentendo di registrare 17 campioni volumici durante ogni risposta funzionale. B. Rendering 3D dell’aumento del volume del sangue cerebrale relativo evocato dalla stimolazione dei baffi (rCBV) rispetto al livello basale. La delineazione anatomica dell’S1BF è indicata in blu. C. Illustrazione del topo nella homecage mobile durante l’esperimento di stimolazione del baffo destro, durante il quale sono stati eseguiti cinque studi da 30 s per un tempo di acquisizione totale di 330 s. D. Corso temporale CBV relativo istantaneo estratto all’interno dell’area attivata (blu), con lo stimolo corrispondente sovrapposto (rosso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. La Figura 6 mostra le correlazioni temporali delle fluttuazioni cbV spontanee normalizzate a bassa frequenza (<0,2 Hz) tra le regioni cerebrali 3D (identificate dalla registrazione al quadro di coordinate comuni di Allen) in un topo anestetizzato ketamina-xilazina. Il tempo totale di acquisizione è stato di 20 minuti (1200 s). L'analisi supervisionata da Atlas ha rivelato forti modelli di connettività interemisferica, con valori di coefficiente di correlazione risultanti fino a 0,8. L'analisi basata su semi nell'ippocampo dorsale ha rivelato una significativa connettività interemisferica tra l'ippocampo destro e sinistro, nonché profonde regioni retro-ippocampali e cortecce piriformi. Una regione di semi selezionata nell'S1BF ha anche determinato un modello di correlazione simmetrico (cortico-corticale), come descritto in precedenza. Figura 6: Connettività funzionale volumetrica transcranica allo stato di riposo del cervello del topo in anestesia ketamina/xilazina valutata su un’acquisizione fUS 3D di 20 minuti. Un. Matrice di correlazione basata su regioni 3D del framework di coordinate comuni di Allen registrate sull’acquisizione funzionale transcraziale. La matrice si ottiene calcolando la correlazione normalizzata di Pearson delle fluttuazioni spontanee a bassa frequenza (<0,1 Hz) dei segnali temporali medi di tutti i voxel inclusi in ciascun ROI identificato dopo la correzione della temporizzazione delle sezioni. Ogni volume campionato è stato scansionato oltre 1,6 mm nella direzione di elevazione (corrispondente a 4 fette) acquisito su 2,2 s. B. Analisi basata su semi proiettata su un modello 3D. Il seme è stato selezionato all’interno dell’ippocampo dorsale destro a β – 2,1 mm. La mappa di correlazione si ottiene calcolando il coefficiente di correlazione di Pearson tra i segnali temporali del seme e ogni voxel dell’intera acquisizione dopo la correzione dei tempi delle sezioni. C. Mappa di correlazione 3D basata su analisi basata su semi con regione di semi selezionata all’interno dell’S1BF a β – 2,1 mm. Barre di scala: 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

I metodi di imaging dell’intero cervello sono strumenti cruciali per comprendere meglio la fisiologia e la patologia del cervello. Il metodo qui descritto consente la quantificazione precisa dei segnali emodinamici nel cervello vivente direttamente al banco. La sensibilità e la risoluzione spazio-temporale senza pari degli ultrasuoni funzionali sono particolarmente adatte per la fisiologia del topo. Le risposte funzionali e le reti a stato di riposo possono essere mappate in tempi di acquisizione brevi, longitudinalmente e senza dover mediare studi o soggetti per ottenere una misura affidabile. La combinazione pertinente di sonde lineari ad ultrasuoni ad alta sensibilità e configurazioni motorizzate veloci consente di eseguire l’imaging fUS volumetrico transcraniale nei topi entro tempi di acquisizione ragionevoli. Questo protocollo può essere eseguito su topi anestetizzati o svegli utilizzando una gabbia per case mobili.

La stimolazione dei baffi, lo stimolo sensoriale usato come esempio illustrativo in questo manoscritto, è un paradigma di attivazione funzionale standard nei roditori e una lettura affidabile per studiare l’elaborazione sensoriale, l’accoppiamento neurovascolare e le loro alterazioni^5,6,10,11. Mentre la spazzolatura manuale grossolana dei baffi può essere preferita per la sua facilità d’uso, questo metodo manca di precisione spaziale e temporale. L’utilizzo di uno stimolatore automatico, come quello qui descritto attivato con lo scanner di imaging fUS, consente un migliore controllo di diversi parametri tra cui il tempo di insorgenza, lo spostamento di ampiezza, la frequenza e l’angolo del Q-tip/pettine, con conseguente migliore riproducibilità tra animali. Inoltre, una tempistica più precisa della stimolazione consente la modellazione della funzione di risposta emodinamica (HRF) determinando il tempo di insorgenza e il tempo di picco dei parametri^12,13. Per garantire una migliore precisione sul numero di baffi deviati durante la stimolazione (e quindi sull’area della regione attivata), stimolatori più sofisticati possono essere adattati a questo protocollo. Molti altri stimoli come la luce⁸, il suono¹⁴ o la presentazione degli odori¹⁵ possono essere implementati utilizzando lo stesso protocollo.

La compatibilità dell’ecografia funzionale con animali svegli e che si comportano è un vantaggio importante rispetto ad altre tecniche di neuroimaging, consentendo la mappatura dell’attivazione funzionale senza il bias dell’anestesia. L’utilizzo di una forca mobile sollevata ad aria è una buona alternativa ad altri apparecchi fissi esistenti come tapis roulant lineari o sferici. Pur essendo saldamente fissato a testa, il movimento dell’homecage dà al mouse l’illusione di navigare nell’ambiente, consentendo di accoppiare una vasta gamma di test comportamentali all’imaging fUS¹⁶. Tuttavia, la procedura di assuefazione al fissaggio della testa costituisce un passo importante per ridurre lo stress, soprattutto per gli esperimenti in cui può essere considerato un fattore confondente. La procedura descritta qui (6 giorni di manipolazione e assuefazione alla fissazione della testa) fornisce risultati robusti per la stimolazione sensoriale e la connettività funzionale dello stato di riposo. Tuttavia, potrebbe essere necessario estendere il periodo di assuefazione per test comportamentali più raffinati¹⁷.

Materials

BD Plastipak 1 mL syringes	Dutscher, France	303172
BD Microlance 26 Gauge needles	Dutscher, France	303800
Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe)	Physitemp	TCAT-2DF
Arduino	Arduino	Arduino Uno-Rev3
Atipamezole	Orion Pharma, France	Antisedan®	5 mg/ml injectable solution
Dental Ciment	Sun Médical, Shiga, japan	Superbond C&B
Depilatory cream	Klorane	N/A
Eye Ointment	TVM, UK	Ocry-gel
Hair trimmer	Wella Profesionnals	N/A
Head plates	Neurotar, Finland	Model 14
Iconeus One standard package for fUS	Iconeus, France	Iconeus One
IcoScan acquisition software (v1.0)	Iconeus, France	IcoScan
IcoStudio analysis software (v1.0)	Iconeus, France	IcoStudio
Isoflurane Anesthesia station	Minerve, Esternay, France
Ketamine	Virbac, France	Ketamine1000	100 mg/ml injectable solution
Lidocaine	Vetoquinol	Lurocaine®	20 mg/ml injectable solution
Medetomidine	Orion Pharma, France	Domitor®	1 mg/ml injectable solution
Meloxicam	Boehringer lingelheim	Metacam®	0.5 mg/ml injectable solution
Mobile HomeCage Large with tracking capability	Neurotar, Finland	MHC-L-T-V4
Monitoring of ECG and breathing rate	AD Systems, (USA) and LabChart software
Servomotor	Feetech	FT90B
Stereotaxic frame	David Kopf (Tujunga, USA)	900-WA	Using Mouse Adaptor  (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922)
Surgical glue	3M, USA	Vetbond
Syringe Pump	KD Scientific, USA	Legato® 130, Cat# 788130
Ultrasound gel	DREXCO medical, France	Medi'Gel
Xylazine 2%	Bayer, France	Rompun®	20 mg/ml injectable solution