Productie van menselijke CRISPR-engineered CAR-T-cellen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor genbewerking in primaire menselijke T-cellen met behulp van CRISPR Cas-technologie om CAR-T-cellen te wijzigen.
Abstract
Adoptieve celtherapieën met behulp van chimere antigeenreceptor T-cellen (CAR-T-cellen) hebben een opmerkelijke klinische werkzaamheid aangetoond bij patiënten met hematologische maligniteiten en worden momenteel onderzocht voor verschillende solide tumoren. CAR-T-cellen worden gegenereerd door T-cellen uit het bloed van een patiënt te verwijderen en ze te manipuleren om een synthetische immuunreceptor tot expressie te brengen die de T-cellen omleidt om doeltumorcellen te herkennen en te elimineren. Genbewerking van CAR-T-cellen heeft het potentieel om de veiligheid van de huidige CAR-T-celtherapieën te verbeteren en de werkzaamheid van CAR-T-cellen verder te verhogen. Hier beschrijven we methoden voor de activering, uitbreiding en karakterisering van menselijke CRISPR-engineered CD19-gerichte CAR-T-cellen. Dit omvat transductie van de CAR lentivirale vector en het gebruik van single guide RNA (sgRNA) en Cas9 endonuclease om genen van belang in T-cellen te targeten. De methoden die in dit protocol worden beschreven, kunnen universeel worden toegepast op andere CAR-constructies en doelgenen die verder gaan dan de genen die voor deze studie worden gebruikt. Bovendien bespreekt dit protocol strategieën voor gRNA-ontwerp, lead gRNA-selectie en doelgen knock-out validatie om reproduceerbaar een hoog-efficiënte, multiplex CRISPR-Cas9-engineering van klinische kwaliteit menselijke T-cellen te bereiken.
Introduction
Chimere antigeenreceptor (CAR)-T celtherapie heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van adoptieve celtherapieën en kankerimmunotherapie. CAR-T-cellen zijn gemanipuleerde T-cellen die een synthetische immuunreceptor tot expressie brengen die een antigeenspecifiek antilichaamfragment met één keten combineert met signaaldomeinen afgeleid van de TCRzeta-keten en kostenimulatorische domeinen die nodig en voldoende zijn voor T-celactivering en co-stimulatie1,2,3,4 . De productie van CAR-T-cellen begint met het extraheren van de eigen T-cellen van de patiënt, gevolgd door ex vivo virale transductie van de CAR-module en uitbreiding van het CAR-T-celproduct met magnetische kralen die functioneren als kunstmatige antigeen presenterende cellen5. Geëxpandeerde CAR-T-cellen worden opnieuw in de patiënt geïnjecteerd, waar ze kunnen enten, doeltumorcellen kunnen elimineren en zelfs meerdere jaren na infusie kunnen aanhouden6,7,8. Hoewel CAR-T-celtherapie heeft geresulteerd in opmerkelijke responspercentages bij B-cel maligniteiten, is klinisch succes voor solide tumoren uitgedaagd door meerdere factoren, waaronder slechte T-celinfiltratie9, een immunosuppressieve tumor micro-omgeving10, antigeen dekking en specificiteit, en CAR-T cel disfunctie11,12 . Een andere beperking van de huidige CAR-T-celtherapie omvat het gebruik van autologe T-cellen. Na meerdere rondes chemotherapie en hoge tumorbelasting kunnen CAR-T-cellen van slechte kwaliteit zijn in vergelijking met allogene CAR-T-producten van gezonde donoren, naast de tijd en kosten die gepaard gaan met de productie van autologe CAR-T-cellen. Genbewerking van het CAR-T-celproduct door CRISPR/Cas9 vertegenwoordigt een nieuwe strategie om de huidige beperkingen van CAR-T-cellen te overwinnen13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 is een tweecomponentensysteem dat kan worden gebruikt voor gerichte genoombewerking in zoogdiercellen18,19. De CRISPR-geassocieerde endonuclease Cas9 kan plaatsspecifieke dubbelstrengsbreuken induceren geleid door kleine RNA’s door base-pairing met de doel-DNA-sequentie20. Bij afwezigheid van een reparatiesjabloon worden dubbelstrengsbreuken gerepareerd door de foutgevoelige niet-homologe eindvoeging (NHEJ) -route, resulterend in frameshiftmutaties of voortijdige stopcodons door insertie- en deletiemutaties (INDELs)19,20,21. Efficiëntie, gebruiksgemak, kosteneffectiviteit en de mogelijkheid voor multiplex genoombewerking maken CRISPR/Cas9 tot een krachtig hulpmiddel om de werkzaamheid en veiligheid van autologe en allogene CAR-T-cellen te verbeteren. Deze aanpak kan ook worden gebruikt om TCR-gerichte T-cellen te bewerken door de CAR-constructie te vervangen door een TCR. Bovendien kunnen allogene CAR-T-cellen met een beperkt potentieel om graft versus host-ziekte te veroorzaken, ook worden gegenereerd door genbewerking van de TCR-, b2m- en HLA-locus.
In dit protocol laten we zien hoe CRISPR-engineering van T-cellen kan worden gecombineerd met virale vectorgemedieerde levering van het CAR-Transgen om genoom-bewerkte CAR-T-celproducten te genereren met verbeterde werkzaamheid en veiligheid. Een schematisch diagram van het gehele proces is weergegeven in figuur 1. Met behulp van deze aanpak hebben we een zeer efficiënte gen knock-out aangetoond in primaire menselijke CAR-T-cellen. Figuur 2A beschrijft in detail de tijdlijn van elke stap voor het bewerken en vervaardigen van T-cellen. Strategieën voor gids RNA-ontwerp en knock-out validatie worden ook besproken om deze aanpak toe te passen op verschillende doelgenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we benaderingen voor genbewerking CAR-T-cellen met behulp van CRISPR Cas9-technologie en produceren we producten om verder te testen op functie en werkzaamheid. Het bovenstaande protocol is geoptimaliseerd voor het uitvoeren van CRIPSR-genbewerking in primaire menselijke T-cellen in combinatie met technische T-cellen met chimere antigeenreceptoren. Dit protocol maakt een hoge knock-out efficiëntie mogelijk met minimale donor-tot-donor variabiliteit. Modificatie met CRISPR kan zowel de werkzaamheid als d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen de Human Immunology Core voor het leveren van normale donor T-cellen en de Flow Cytometry Core aan de Universiteit van Pennsylvania.
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
Referências
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Pesquisa do Câncer. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O’Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
