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Genetics

लैब कक्षाओं में D1S80 लोकस का उपयोग कर डीएनए फिंगरप्रिंटिंग का आवेदन

Published: July 17, 2021 doi: 10.3791/62305
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 4, 1,2,3
1Institute of Plant Genetics, Heinrich-Heine-University, 2Cluster of Excellence on Plant Sciences "SMART Plants for Tomorrow's Needs", 3Max Planck Institute for Plant Breeding Research, 4IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich GmbH
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम एपिथेलियल सेल डीएनए से वीएनटीआर लोकस D1S80 को बढ़ाना द्वारा डीएनए फिंगरप्रिंटिंग प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

जैविक विज्ञान में, डीएनए फिंगरप्रिंटिंग व्यापक रूप से पितृत्व परीक्षण, फोरेंसिक अनुप्रयोगों और फिलोजेनेटिक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है । यहां, हम स्नातक प्रयोगशाला कक्षाओं के संदर्भ में वेरिएबल नंबर ऑफ टैंडेम रिपीट (वीएनटीआर) विश्लेषण द्वारा जीनोटाइपिंग व्यक्तियों के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत विधि का वर्णन करते हैं। मानव D1S80 VNTR लोकस दोहराव दृश्यों की संख्या में भिन्नता के आधार पर एक अत्यधिक बहुरूपी मार्कर के रूप में इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है।

यह सरल प्रोटोकॉल शिक्षकों के लिए उपयोगी जानकारी और व्यावहारिक प्रयोगशाला कक्षाओं में डीएनए फिंगरप्रिंटिंग के कार्यान्वयन को व्यक्त करता है । प्रस्तुत प्रयोगशाला अभ्यास में, पीसीआर प्रवर्धन के बाद डीएनए निष्कर्षण का उपयोग D1S80 VNTR लोकस में आनुवंशिक भिन्नता निर्धारित करने के लिए किया जाता है। पीसीआर उत्पादों के टुकड़े आकार में अंतर एगरल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा कल्पना की जाती है। टुकड़ा आकार और दोहराने की संख्या एक डीएनए आकार मानक के आकार और प्रवास दूरी के एक रैखिक प्रतिगमन के आधार पर गणना कर रहे हैं ।

इस गाइड के बाद, छात्रों को सक्षम होना चाहिए:

• फसल और बुक्कल म्यूकोसा एपिथेलियल कोशिकाओं से डीएनए निकालने
• पीसीआर प्रयोग करें और विभिन्न प्रतिक्रिया घटकों के कार्य को समझें
• एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा एम्प्लिकॉन का विश्लेषण करें और परिणामों की व्याख्या करें
• डीएनए फिंगरप्रिंटिंग में वीएनटीआर के उपयोग और जैविक विज्ञान में इसके आवेदन को समझें

Introduction

आणविक फिंगरप्रिंटिंग, जिसे डीएनए फिंगरप्रिंटिंग भी कहा जाता है, को सर एलेक जेफरीज ने १९८४१में लीसेस्टर विश्वविद्यालय में जेनेटिक्स विभाग में काम करते हुए पेश किया था । यह मानव जीनोम के 0.1% पर आधारित है जो व्यक्तियों के बीच अलग है और इसमें लगभग तीन मिलियन वेरिएंट शामिल हैं। जीनोटाइप में ये अद्वितीय अंतर व्यक्तियों के बीच भेदभाव के लिए अनुमति देते हैं और इसलिए मोनोज़िगोटिक जुड़वां बच्चों को छोड़कर आनुवंशिक फिंगरप्रिंट के रूप में कार्य कर सकते हैं। नतीजतन, डीएनए फिंगरप्रिंटिंग का उपयोग विभिन्न व्यक्तियों की संबंधितता के अनुमान के लिए किया जाता है जो पितृत्व परीक्षण या जनसंख्या विविधता अध्ययन में उदाहरण के लिए लागू होता है। हमारी प्रयोगशाला कक्षाओं में हम डीएनए फिंगरप्रिंटिंग और एलील आवृत्तियों की अवधारणा को व्यक्त करने के उद्देश्य से । यहां वर्णित विधि D1S80 लोकस में टैंडेम रिपीट्स (VNTR) की चर संख्या का विश्लेषण करके आनुवंशिक फिंगरप्रिंटिंग के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत विधि को दर्शाती है। इस विधि में D1S80 लोकस को बढ़ाने के लिए बुक्कल म्यूकोसा एपिथेलियल कोशिकाओं और बाद में पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) से डीएनए का निष्कर्षण शामिल है, जिसके बाद एक एगर उठे जेल पर टुकड़ा लंबाई अंतर का दृश्य है।

D1S80 VNTR minisatellite लोकस अत्यधिक चर है और गुणसूत्र 1 (1p36-p35) के टेलोमेरिक क्षेत्र में स्थित है। इसकी पहचान की गई थी और १९९० में करसाई और सहकर्मियों द्वारा 16 बीपी की एक कोर दोहराने इकाई के साथ एक लोकस के रूप में वर्णित किया गया था, जो सिर्फ एक इकाई2से भिन्न एलील्स के पृथक्करण के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, D1S80 लगभग 7.77 x 10-53की उत्परिवर्तन दर के साथ भिन्नता की एक उच्च डिग्री दिखाता है। D1S80 में उच्च स्तर की विषमता4,5 (उदाहरण के लिए, कोकेशियान 6 के लिए 80.8% विषमता और अफ्रीकी-अमेरिकियों के लिए 87% विषमता7)है। इसके अतिरिक्त, D1S80 लोकस अधिकांश आबादी में बहुरूपी है, आम तौर पर 15 से अधिक विभिन्न एलील्स 14 से 41 दोहराते हैं। D1S80 alleles की आवृत्ति आबादी के बीच भिन्न होती है। 24 रिपीट इकाइयों (एलील 24) के साथ एलील यूरोपीय और एशियाई आबादी में सबसे अधिक बार होता है, जबकि एलील 21 अफ्रीकीआबादी 4, 7,8,9,10में सबसे आम है। नतीजतन, एली फ्रीक्वेंसी वितरण विभिन्न मानव आबादी के लिए नैदानिक हैं और संबंधितता के अनुमान (उदाहरण के लिए, पितृत्व परीक्षणों में) के आकलन के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए। 

डी1एस80 वीएनटीआर लोकस का पीसीआर आधारित प्रवर्धन फोरेंसिक विज्ञान, पितृत्व परीक्षण, रोग विश्लेषण और जनसंख्या विविधता अध्ययन11,12, 13,14में एक बहुत ही उपयोगीतरीकारहा है । जबकि आज फोरेंसिक में वीएनटीआरएस के उपयोग को छोटे टैंडेम रिपीट्स द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है, D1S80 VNTR लोकस का व्यापक रूप से मूल और आनुवंशिक संबंधों के निर्धारण में उपयोग किया जाता है और आबादी के बीच4,8,9,11। इसके अलावा , इसका उपयोग अक्सर व्यावहारिक प्रयोगशाला कक्षा15,16में डीएनए फिंगरप्रिंटिंग सिखानेकेलिए किया जाता है । यहां वर्णित विधि स्नातक प्रयोगशाला कक्षाओं में बहुत अधिक सफलता दर के साथ एक मजबूत, लागत प्रभावी और उपयोग में आसान विधि का प्रतिनिधित्व करती है। इस लेख का उद्देश्य बुक्कल म्यूकोसा एपिथेलियल कोशिकाओं से मानव D1S80 मिनीस्टेलाइट लोकस के आणविक विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह का अवलोकन प्रदान करना है। इसमें तकनीकों का प्रदर्शन, सरलीकृत प्रोटोकॉल और पहले प्रकाशित कार्यों में वर्णित व्यावहारिक सुझाव2,17शामिल हैं।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग केवल तभी किया जाना है जब छात्र या संबंधित कानूनी अभिभावक इस प्रोटोकॉल के संचालन के लिए सहमत हुए क्योंकि जीनोटिक प्रोफाइल आनुवंशिक संबंधों में अंतर्दृष्टि देते हैं। डीएनए फिंगरप्रिंटिंग मुख्य रूप से जनसंख्या अध्ययन और फोरेंसिक मामलों पर लागू एक आम आणविक जीव विज्ञान विधि है । इसलिए, प्रदूषण जोखिमों को यथासंभव कम रखने के लिए ध्यान समर्पित किया जाना चाहिए। बाहर के स्रोत या DNases से डीएनए के साथ नमूने के प्रदूषण से बचने के लिए, दस्ताने पहने जाने चाहिए, उपकरणों को अच्छी तरह से साफ या निष्फल किया जाना चाहिए और उपयोग से पहले समाधान को फ़िल्टर-निष्फल या ऑटोक्लेव किया जाना चाहिए।

1. बुक्कल म्यूकोसा एपिथेलियल कोशिकाओं की कटाई

सावधानी: लार और एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ काम संक्रामक रोगों के संचरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसलिए, मानक और संचरण आधारित सावधानियों को लागू किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग)।

नोट: एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल करें, जो प्रशिक्षक द्वारा प्रदान किया जाता है (उदाहरण के लिए, प्रशिक्षक द्वारा निकाले गए डीएनए) और डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण चरणों में शामिल हैं।

  1. नमूना संग्रह से पहले दांतों को खाने या ब्रश करने के बाद कम से कम 1 घंटे इंतजार करें।
  2. एक खाली और बाँझ 2.0 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब लेबल करें।
  3. पैकेजिंग से एक बाँझ बुक्कल झाड़ू निकालें और 30-40 बार या 30-40 सेकंड के लिए गाल के अंदर पर सख्ती से रगड़ें ताकि बुकल म्यूकोसा एपिथेलियल कोशिकाओं को फसल दी जा सके।
  4. संग्रह झाड़ू की नोक को पहले लेबल वाले बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें और प्लास्टिक की लंबाई को तोड़ दें जो किनारे से परे फैली हुई है, या तो हाथ से या बाँझ कैंची का उपयोग करके।
  5. टोपी को ट्यूब पर सुरक्षित रूप से रखें, संग्रह झाड़ू को अंदर सील करें।

2. मानव कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए का निष्कर्षण

  1. निकालने से पहले, सैंपल लाइसिस के लिए थर्मल मिक्सर या हीटिंग ब्लॉक को 65 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    सावधानी: उपयोग किए जाने वाले कुछ रसायनों को खतरनाक वर्गीकृत किया जाता है। सेफ्टी डाटा शीट को ध्यान से पढ़ें और हैंडलिंग से पहले उचित सुरक्षा उपाय करें।
    1. सभी आवश्यक बफ़र्स और समाधानों (लाइसिस समाधान, 8 एम पोटेशियम एसीटेट, 2-प्रोपेनियम, 70% इथेनॉल और एल्यूशन बफर) को फ़िल्टर या ऑटोक्लेव करके तैयार और निष्फल करें।
      नोट: सभी अपकेंद्रित्र कदम कमरे के तापमान (20-30 डिग्री सेल्सियस) पर किया जाना चाहिए जब तक कि निर्दिष्ट नहीं किया जाए।
  2. लाइसिस सॉल्यूशन (50 एमएम ट्रिस/एचसीएल, पीएच 8.0; 10 एमएम एथिलेन्डियामाइन टेट्रा-एसिटिक एसिड (ईडीटीए) के 500 माइक्रोन जोड़ें; 2% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस)) बुकल झाड़ू में, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि नमूना पूरी तरह से लाइसिस समाधान में डूब गया है।
    1. भंवर सख्ती से कम से कम 5 एस के लिए।
    2. 10 मिनट के लिए एक थर्मल मिक्सर में 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट नमूने।
    3. इनक्यूबेशन के दौरान 5 एस के लिए पल्स-भंवर द्वारा 3-4 बार नमूना मिलाएं।
    4. लाइसिस बफर से झाड़ू निकालें, अधिकतम नमूना मात्रा प्राप्त करने के लिए ट्यूब के अंदर के खिलाफ झाड़ू दबाएं।
  3. lysed कोशिकाओं के लिए 8 मीटर पोटेशियम एसीटेट के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    1. ट्यूब को उलटा करके अच्छी तरह से मिलाएं जब तक कि सफेद तेज़ी न हो।
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  4. 18,000 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए नमूना सेंट्रलाइज करें।
  5. सुपरनैंट के 450 माइक्रोल को एक साफ और बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. 2-प्रोपेनोल के 450 माइक्रोन जोड़ें और ट्यूब (डीएनए की वर्षा) को उलटा करके अच्छी तरह से मिलाएं।
  7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  8. 18,000 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
  9. सुपरनैंट को त्यागें और गोली को सुखाने और क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए एक साफ पेपर तौलिया पर ट्यूब को उलट दें।
  10. एक हीटिंग ब्लॉक में 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए डीएनए को इनक्यूबेट करें ताकि गोली को पूरी तरह से सुखा दिया जा सके।
  11. डीएनए को धोने के लिए, 70% इथेनॉल के 500 माइक्रोन जोड़ें।
  12. 18,000 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
  13. सुपरनेट को त्यागें और गोली को सुखाने के लिए एक साफ कागज तौलिया पर ट्यूब को उलट दें।
  14. गोली में 30 माइक्रोनल रिस्पेजन बफर (10 एमएम ट्रिस/एचसीएल पीएच 8.0, 1 एमएम ईडीटीए) जोड़ें।
  15. डीएनए को निष्क्रिय करने के लिए एक हीटिंग ब्लॉक में 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए डीएनए को इनक्यूबेट करें।

3. पीसीआर का उपयोग कर D1S80 VNTR लोकस बढ़ाना

नोट: आवश्यक प्लास्टिक और अन्य सामग्रियों को इकट्ठा करने से पहले आवश्यक अभिकर् ती और उनके वॉल्यूम के साथ उपयोग किए जाने वाले नमूनों की संख्या रिकॉर्ड करें और एक वर्कशीट तैयार करें। सैंपल नंबर के साथ पीसीआर के लिए इस्तेमाल की जाने वाली बाँझ ट्यूब/स्ट्रिप/प्लेट्स को लेबल करें । पीसीआर को मान्य करने के लिए डीएनए के बजाय एच2ओ का उपयोग करके एक नकारात्मक नियंत्रण और एक सकारात्मक नियंत्रण (उदाहरण के लिए, प्रशिक्षक द्वारा प्रदान किए गए डीएनए का उपयोग करना) शामिल करना याद रखें।

  1. 1x पीसीआर मास्टर मिक्स जिसमें 5x पीसीआर रिएक्शन बफर (जिसमें 15 mM MgCl2),1 माइक्रोन ऑफ डिऑक्सीरिबोक्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (डीएनटीपीएस) (10 mM), 5 माइक्रोल (10 pmol) प्रत्येक प्राइमर का 10 माइक्रोल (10 pmol) होता है। Kasai et al के अनुसार pMCT118-f और pMCT118-r (फॉरवर्ड-5'-GAAACTGGCCTCCAACACACTGCCCCCCCCCCCCCCG-3', रिवर्स-5'-GTCTTGTTGATAGATCACGGGCCCCCCCCCCGGC-3') ।2,अल्ट्रापुरे एच 2 ओ के23.8माइक्रोन, और 0.2 μL Taq डीएनए बहुलक (5 U/μL) ।
    नोट: प्राइमर pMCT118-f/pMCT118-r D1S80 VNTR क्षेत्र के flanking क्षेत्रों पर डिजाइन किए गए थे पूरे लोकस बढ़ाना ।
  2. पीसीआर ट्यूब/स्ट्रिप/प्लेट को उपयोग किए जाने वाले नमूना नंबरों के साथ लेबल करें।
  3. प्रत्येक लेबल पीसीआर नमूना ट्यूब या अच्छी तरह से मास्टर मिश्रण के Aliquot 45 μL।
  4. प्रत्येक पीसीआर ट्यूब/प्लेट में मास्टर मिक्स में डीएनए टेम्पलेट के 5 माइक्रोन जोड़ें ताकि 50 माइक्रोन की कुल मात्रा प्राप्त की जा सके। क्रॉस संदूषण से बचने के लिए हर डीएनए नमूने के लिए पिपेट टिप बदलें।
  5. डीएनए के बजाय अल्ट्रापुरे एच2ओ का इस्तेमाल कर नो टेम्पलेट कंट्रोल (एनटीसी) शामिल करें।
  6. पीसीआर ट्यूब/स्ट्रिप्स या सील प्लेट बंद करें और मिक्स करें।
  7. एक टेबलटॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग कर 20 एस के लिए पीसीआर ट्यूबों/स्ट्रिप्स/प्लेटों को अपकेंद्रित्र करें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में दी गई पीसीआर शर्तों को डीएनए पॉलीमरेज और पीसीआर थर्मल साइकिलर का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था। सामान्य तौर पर, पीसीआर की स्थिति को डीएनए पॉलीमरेज के अनुकूल होना चाहिए। एक Taq डीएनए बहुलक के लिए मानक विस्तार समय 1 मिनट/kb है ।
  8. नमूना ट्यूबों/स्ट्रिप्स/प्लेट को थर्मोसाइकिलर में रखें और निम्नलिखित शर्तों (डीएनए पॉलीमरेज एक्सटेंशन टाइम) का उपयोग करके प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस का 1 चक्र; 15 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्र, 15 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस का 1 चक्र।
  9. जब प्रोग्राम पूरा हो जाए, तो थर्मोसाइकिलर से उत्पादों को हटा दें और इलेक्ट्रोफोरेसिस तक रात भर 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. पीसीआर उत्पादों के एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस

  1. 1.5% एगर उठे जेल तैयार करें।
    1. 1.5 ग्राम एग्राज पाउडर का उपयोग करें और इसे फ्लास्क में 1x ट्रिस-एसीटेट-ईडीए (टीएई) बफर समाधान के 100 एमएल के साथ मिलाएं।
    2. एक माइक्रोवेव ओवन (600 डब्ल्यू) में लगभग 1.5-2 मिनट के लिए मिश्रण गर्म करें। सामग्री को फिर से हिलाएं और यदि आवश्यक हो, तो एगर उठे को पूरी तरह से भंग करने के लिए। थोड़ा ठंडा करें और एगर उठे में पेकग्रीन के 2 माइक्रोन जोड़ें।
    3. सभी नमूनों के लिए पर्याप्त कुओं के साथ एक कंघी का उपयोग कर एक रूप में जेल डालो और कम से कम एक आणविक वजन मार्कर जोड़ें।
      सावधानी: उबलते मंदता हो सकती है। फ्लास्क को सावधानी से हिलाएं जब एगर उठे जो अभी तक भंग नहीं किया गया है।
      नोट: पेकग्रीन न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए एक गैर विषैला डाई है। यह डबल फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) और एकल फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) के साथ-साथ आरएनए के धुंधला होने के लिए लागू होता है । संवेदनशीलता एथिडियम ब्रोमाइड के बराबर है।
  2. पीसीआर उत्पादों को 4 डिग्री सेल्सियस से हटाएं और लगभग 10 एस के लिए सेंट्रलाइज करें।
  3. 10 माइक्रोन सैंपल के साथ जेल के कुओं को लोड करें। जेल को ओवरलोड न करें।
    नोट: डीएनए पॉलीमरेज बफर में ऐसे यौगिक भी शामिल हैं जो नमूना घनत्व को बढ़ाते हैं ताकि नमूनों को लोडिंग डाई की आवश्यकता के बिना सीधे जैल पर लोड किया जा सके। यह नमूना कुएं में डूबने की अनुमति देता है और रंगों को यह ट्रैक करने में मदद करता है कि डीएनए नमूना कितनी दूर चला गया है।
    1. फ्लैंकिंग कुओं में आणविक वजन मानक जोड़ें (अधिमानतः 50 बीपी आणविक वजन मानक)।
      नोट: अवशिष्ट पीसीआर नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, यदि एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस को दोहराया जाना है।
  4. लगभग 40 मिनट के लिए 150 वी (स्थिर) पर 1x TAE रनिंग बफर में जेल चलाएं या जब तक कि निचले पीले रंग के रंग के सामने जो लगभग 50 बीपी पर यात्रा करता है जेल के निचले छोर तक पहुंच जाता है।
  5. जेल की छवि जबकि नीली रोशनी या पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश लागू किया जाता है और टुकड़ा लंबाई विश्लेषण के लिए एक छवि रिकॉर्ड।
    सावधानी: यूवी प्रकाश आपकी आंखों और त्वचा को नुकसान पहुंचा सकता है। यूवी लाइट बॉक्स का उपयोग करते समय हमेशा सुरक्षात्मक कपड़े और यूवी सुरक्षा चश्मा पहनें।
  6. संस्थागत खतरनाक सामग्री नीति के अनुसार जेल का निपटान करें।

5. टुकड़ा लंबाई परिणामों का विश्लेषण

नोट: टुकड़ों की लंबाई का अनुमान लगाने के लिए रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करें।

  1. D1S80 पीसीआर टुकड़ों को आकार देने के लिए, 50 बीपी आणविक वजन मानक लेन पर जेल तस्वीर पर एक शासक रखें ताकि शासक के ऊपर अच्छी तरह से नीचे के साथ लाइनों जिसमें नमूना लोड किया गया था(चित्रा 1)।
    नोट: आणविक वजन मानक (50 बीपी आणविक वजन मानक) के लिए रैखिक प्रतिगमन समीकरण की गणना करने के लिए एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम का उपयोग किया गया था।
  2. स्प्रेडशीट प्रोग्राम(चित्रा 2)का उपयोग करके एक तालिका में 50 बीपी आणविक वजन मानक के प्रत्येक बैंड के लिए कुएं से दूरी रिकॉर्ड करें (उदाहरण के लिए, सेमी में)।
  3. 50 बीपी आणविक वजन मानक के प्रत्येक टुकड़े आकार के लॉग (जैसे, आधार 10) निर्धारित करें और लॉग मानों को तालिका(चित्रा 2)में दर्ज करें।
  4. प्रत्येक डेटा को ऊर्ध्वाधर धुरी (वाई-एक्सिस) पर बैंड के आकार के लॉग के साथ एक ग्राफ की ओर इंगित करें और जेल के शीर्ष से मापा गया रन दूरी क्षैतिज धुरी (एक्स-एक्सिस) पर आणविक वजन मानक के प्रत्येक बैंड के लिए एक स्कैटरप्लॉट(चित्रा 3)का उपयोग करके।
  5. एक ट्रेंडलाइन (रैखिक प्रतिगमन रेखा) फिट करें और प्रतिगमन समीकरण (वाई = एक्स + बी) और ग्राफ(चित्र 4)पर आर2 मूल्य दिखाएं।
  6. प्रत्येक D1S80 एम्प्लिकॉन(चित्रा 5)के लिए माइग्रेट की दूरी (उदाहरण के लिए, सेमी में) को मापें।
  7. प्रतिगमन समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक D1S80 एम्प्लाइसन के आकार का अनुमान लगाएं: वाई = एक्स + बी
    जहां y = टुकड़ा आकार के लॉग
    a = लाइन की ढलान (बिंदु 5 में गणना)
    x = कुएं से दूरी (सेमी में)
    b = वह बिंदु जहां प्रतिगमन रेखा वाई-एक्सिस को रोकती है (बिंदु 5 में गणना)
    नोट: चूंकि वाई-वैल्यू टुकड़े के आकार के लॉग का प्रतिनिधित्व करती है, इसलिए एंटीलॉग(10 वाई)की गणना D1S80 एम्प्लिकॉन के बीपी में टुकड़ा आकार प्राप्त करने के लिए की जानी चाहिए।

6. परीक्षण किए गए व्यक्तियों के एलील्स में दोहराने वाली इकाइयों की संख्या का आकलन

नोट: D1S80 दोहराने इकाई लंबाई में 16 बीपी है । D1S80 के लिए सबसे छोटा ज्ञात allele 14 दोहराता है । यहां वर्णित एम्प्लिकॉन योजना अंतिम आकार में अतिरिक्त 145 बीपी जोड़ने वाले क्षेत्रों के साथ एम्प्लिकॉन का उत्पादन करती है।

  1. प्रत्येक पीसीआर टुकड़े में कितनी दोहराने वाली इकाइयां निहित हैं, इसका अनुमान लगाने के लिए तालिका 1 का उपयोग करें। रैखिक प्रतिगमन का उपयोग करके एक्सपेरिमेंट किया गया आकार किसी विशेष एलील के 8 बीपी के भीतर होना चाहिए।
  2. एलील रिपीट आकार संख्या के संयोजन के रूप में प्रत्येक परीक्षण किए गए व्यक्ति के जीनोटाइप को रिकॉर्ड करें।

Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, D1S80 VNTR मार्कर विश्लेषण मानव जीनोमिक डीएनए पर किया गया था जो झाड़ू नमूने(चित्र 6)द्वारा काटा गया बुकल म्यूकोसा एपिथेलियल कोशिकाओं से निकाला गया था। पीसीआर का उपयोग करके प्रवर्धन के बाद, D1S80 एम्प्लिकॉन युक्त एक एगर उठे जेल का एक विशिष्ट प्रतिनिधित्व चित्र 1में दिखाया गया है। लेन 1 ५० बीपी आणविक वजन मानक से पता चलता है । आणविक वजन मानक के बगल में, आठ छात्र नमूनों से पीसीआर उत्पादों की कल्पना की जाती है। लेन 10 एनटीसी को दिखाता है जिसमें टेम्पलेट डीएनए के बजाय पानी का इस्तेमाल किया जाता था । विश्लेषण नमूनों के अधिकांश स्पष्ट रूप से दो बैंड प्रदर्शित करते हैं, D1S80 लोकस के लिए विषम व्यक्तियों का प्रतिनिधित्व करते हैं । लेन 2 और लेन 9 D1S80 लोकस के लिए होमोज़िगस व्यक्तियों का प्रतिनिधित्व करने वाला एक बैंड दिखाते हैं। लेन 5 एक अस्पष्ट एकल बैंड दिखा रहा है जो अन्य बैंड की तुलना में बहुत व्यापक है । यह केवल एक दोहराने इकाई में भिन्न दो D1S80 एलील्स का परिणाम हो सकता है। आगे के विश्लेषण के लिए, लेन 5 में नमूना एक एकल बैंड के रूप में माना जाएगा, एक homozygous व्यक्ति का प्रतिनिधित्व ।

सत्यापित पीसीआर उत्पादों पर किए गए डाउनस्ट्रीम जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस टुकड़ा विश्लेषण का उपयोग विभिन्न छात्र नमूनों के D1S80 वीएनटीआर लोकस के आकार कॉलिंग के लिए किया गया था। पीसीआर विश्लेषण द्वारा प्राप्त एम्प्लिकॉन आकारों की व्याख्या आणविक वजन मानक पर निर्भर करती है। आणविक वजन मानक के प्रत्येक बैंड के लिए अच्छी तरह से दूरी(चित्रा 1)मापा गया था और दर्ज(चित्रा 2)। आकार और प्रवास दूरी के आधार पर व्यक्तिगत बैंड के आकार की गणना रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करके की जा सकती है। लॉग (आधार 10) छात्र नमूनों(चित्रा 5)में प्रत्येक बैंड के लिए निर्धारित किया गया था और संबंधित एंटीलॉग प्रत्येक एम्प्लिकॉन के लिए बीपी की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । पुन: दोहराने वाली इकाइयों की संख्या की गणना प्राप्त एम्प्लिकॉन आकार(तालिका 2)के अनुसार की जा सकती है।

प्रत्येक छात्र के नमूने के लिए एम्प्लिकॉन आकारों की गणना रैखिक प्रतिगमन द्वारा की जाती थी और प्रत्येक बैंड को टेबल 2में दिखाए गए एक विशेष एलील को आसानी से सौंपा जा सकता था। D1S80 allele आकार पर जानकारी तो स्नातक छात्रों की छोटी आबादी सबसेट के बीच allele आवृत्तियों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 28-दोहराने एलील इस दोहराने एली (व्यक्तियों 1 और 4) के लिए दो होमोज़िगस व्यक्तियों के कारण छात्रों के बीच सबसे अधिक बार होता है। दूसरा सबसे बार एलील 18-दोहराने वाले एलील है, जो होमोज़िगस व्यक्तिगत 8 और विषम व्यक्ति 6 द्वारा किया जाता है। कम आवृत्ति एलील्स क्रमशः 6, 5 और 3 व्यक्तियों में केवल एक बार पाए जाने वाले 21-, 26 और 30-दोहराने वाले एलील्स हैं। छोटे छात्र आबादी के D1S80 VNTR लोकस के एलील फ्रीक्वेंसी पैटर्न की तुलना बड़ी मानव आबादी की एलील फ्रीक्वेंसी से की जा सकती है, उदाहरण के लिए विभिन्न महाद्वीपों4,7,8,9,10से निकलने वाली आबादी ।

छात्रों में, व्यक्तियों 2 और 3 शेयर 24-दोहराने allele, व्यक्तियों 2 और 7 शेयर 20 दोहराने allele और व्यक्तियों 5 और 7 शेयर 23-दोहराने allele । दिलचस्प बात यह है कि दो D1S80 होमोज़िगस व्यक्ति (व्यक्तिगत 1 और 4) 28-दोहराने वाले एलील को साझा करते हैं। दो व्यक्तियों के बीच मिलान एलील्स एक संभावित संबंधितता का संकेत कर सकते हैं। हालांकि, साझा एलील्स भी संयोग से हो सकते हैं। इस प्रकार, दो व्यक्तियों के बीच एक एलील मैच की संभावना निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। संभावना सामान्य आबादी में व्यक्तिगत एलील्स की एलील आवृत्ति पर निर्भर करती है और सांख्यिकीय दृष्टिकोणों को वीएनटीआर मार्कर विश्लेषण जैसे बायेसियन दृष्टिकोण के लिए सांख्यिकीय वजन संलग्न करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए। संक्षेप में, प्रस्तुत फिंगरप्रिंटिंग विधि डीएनए फिंगरप्रिंटिंग में VNTRs के उपयोग और जैविक विज्ञान में इसके आवेदन को पढ़ाने के लिए हाथ पर वर्ग व्यावहारिक में उपयोग किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1:50 बीपी आणविक वजन मानक लेन के बगल में रखे एक शासक के साथ D1S80 प्रवर्धन उत्पादों के इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद एक एगरल्ड जेल का प्रतिनिधित्व। लेन 1 में 50 बीपी आणविक वजन मानक होता है, जबकि लेन 2-9 में पीसीआर रिएक्शन उत्पाद होते हैं। लेन 10 में नो टेम्पलेट कंट्रोल (एनटीसी) होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:डीएनए खंड प्रवास दूरी का निर्धारण और ५० बीपी आणविक वजन मानक के प्रत्येक टुकड़ा आकार के लॉग इन करें । 50 बीपी आणविक वजन मानक के प्रत्येक बैंड के लिए कुएं (सेमी में) से दूरी दर्ज की जाती है और प्रत्येक टुकड़े के लिए लॉग (आधार 10) निर्धारित किया जाता है। मानों स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करके तालिका में प्रवेश किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:वाई-एक्सिस पर प्रत्येक टुकड़े के आकार के लॉग (आधार 10) के खिलाफ एक्स-एक्सिस पर आणविक वजन मानक की डीएनए खंड माइग्रेशन दूरी की साजिश रचने से उत्पन्न स्कैटर प्लॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4-रैखिक प्रतिगमन रेखा और प्रतिगमन समीकरण के साथ-साथ डेटा के लिए आर2 मूल्य का शोषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: D1S80 एम्प्लिकॉन के आकार का निर्धारण। प्रत्येक टुकड़े के लिए कुएं से दूरी प्रतिगमन समीकरण में प्रवेश किया है। वाई-वैल्यू का एंटीलॉग बीपी में टुकड़े के आकार का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: D1S80 VNTR विश्लेषण के लिए सुझाए गए समय रेखा और कार्यप्रवाह। पूरे D1S80 VNTR विश्लेषण प्रक्रिया यहां प्रस्तुत, बुक्कल एपिथेलियल सेल संचयन से टुकड़ा लंबाई मूल्यांकन करने के लिए, एक ही कार्य दिवस के भीतर पूरा किया जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एलील आकार (बीपी में) दोहराने की संख्या
369 14
385 15
401 16
417 17
433 18
449 19
465 20
481 21
497 22
513 23
529 24
545 25
561 26
577 27
593 28
609 29
625 30
641 31
657 32
673 33
689 34
705 35
721 36
737 37
753 38
769 39
785 40
801 41

तालिका 1: प्रत्येक D1S80 VNTR लोकस के लिए एम्प्लिकॉन आकार।

व्यक्ति एलील दूरी (सेमी में) आकार (बीपी में) दोहराने इकाइयों की संख्या
1 समोसेदार 5 600 28
2 विषमता 5.2 ; 5.5 535, 458 24, 20
3 विषमता 4.9 ; 5.2 626, 535 30, 24
4 समोसेदार 5 600 28
5 विषमता 5.1 ; 5.3 564, 508 26, 23
6 विषमता 5.4 ; 5.6 483, 435 21, 18
7 विषमता 5.3 ; 5.5 508, 458 23, 20
8 समोसेदार 5.6 435 18

तालिका 2: विभिन्न व्यक्तियों की एलील संरचना का परीक्षण किया गया। रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा प्राप्त एम्प्लिकॉन आकार के अनुसार दोहराने वाली इकाइयों की संख्या का अनुमान लगाया जा सकता है।

Discussion

यहां हमने स्नातक व्यावहारिक कक्षाओं में आणविक फिंगरप्रिंटिंग को लागू करने के लिए एक सरल और लागत कुशल विधि का वर्णन किया ।

D1S80 लोकस में आनुवंशिक भिन्नता के लिए स्क्रीन करने के लिए, डीएनए निष्कर्षण और विश्लेषण के साथ मानव जैविक नमूना संग्रह की आवश्यकता है। यह आवश्यक है कि पूरी प्रक्रिया में मानव जैविक नमूनों का नैतिक उपयोग सुनिश्चित किया जाए। नमूना प्रबंधन को एक व्यापक नियामक ढांचे के भीतर नियंत्रित किया जाता है जो नमूनों और संबद्ध डेटा18 (उदाहरण के लिए, मानव जैविक सामग्री के उपयोग के लिए सहमति) का सही उपयोग सुनिश्चित करता है। प्रतिभागियों को उनके नमूनों के उपयोग, आनुवंशिक संबंधों में विसंगतियों की खोज के जोखिम (उदाहरण के लिए, संबंधित व्यक्तियों के लिए), जैविक नमूनों और डेटा के भविष्य के भंडारण के लिए गोपनीयता संरक्षण और इरादों के बारे में ठीक से सूचित किया जाना चाहिए । सभी दानदाताओं (छात्रों या सहकर्मियों) को स्वतंत्र रूप से सहमति देनी चाहिए और बिना कारण दिए वापस लेने के अधिकार को समझना चाहिए । सामान्य तौर पर, इस प्रयोगशाला वर्ग के संचालन से पहले मानव नमूना प्रबंधन के लिए संबंधित दिशानिर्देशों और विनियमों से परिचित होना अपरिहार्य है।

स्नातक प्रयोगशाला पाठ्यक्रमों में बुक्कल म्यूकोसा एपिथेलियल कोशिकाओं के संग्रह के लिए, ऑपरेटर से या DNases के साथ डीएनए नमूनों के संदूषण से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए । यह सिफारिश की जाती है कि प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और सुरक्षात्मक चश्मे का उपयोग हमेशा बाँझ झाड़ू और माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के साथ किया जाता है। बुक्कल स्वाब आधारित सेल हार्वेस्टिंग को पीसीआर-आधारित वीएनटीआर विश्लेषण के लिए उपयुक्त आनुवंशिक सामग्री के संग्रह के लिए एक सुविधाजनक और लागत प्रभावी तरीका माना जाता है, क्योंकि यह अपेक्षाकृत सस्ती और गैर-निवास है। बुक्कल झाड़ू के अलावा, लार चिकित्सा अनुसंधान के लिए सबसे आम मौखिक नमूना विधि है। यह दिखाया गया है कि बुक्कल झाड़ू में लार की तुलना में एपिथेलियल कोशिकाओं का अनुपात अधिक होता है, जिससे उन्हें पीसीआर आधारित D1S80 VNTR विश्लेषण19,20के लिए पर्याप्त मात्रा और डीएनए की गुणवत्ता प्रदान करने में अधिक विश्वसनीय बना दिया जाता है । इसके अतिरिक्त, 21 जनसंख्या विविधता अध्ययनों में, उदाहरण के लिए, उपयोग किए जाने परभौगोलिकबाधाओं पर काबू पाने के लिए स्व-संग्रह के बाद बुक्कल झाड़ू को बाहर निकाला जा सकता है।

विभिन्न कंपनियों से निष्कर्षण किट के विकास के कारण डीएनए निष्कर्षण अपेक्षाकृत आसान हो गया है। फिर भी, उन किटों का उपयोग सीमित वित्तीय संसाधनों के कारण प्रयोगशाला कक्षाओं में उपयुक्त नहीं हो सकता है। यहां, हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए निष्कर्षण किट की जरूरत के बिना मानव नमूनों से डीएनए निष्कर्षण के लिए एक आसान, तेजी से और लागत कुशल विधि प्रस्तुत की । डीएनए निष्कर्षण विधि वर्णित कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग नहीं करता है, इसके बजाय सेलुलर प्रोटीन एक 8 एम पोटेशियम एसीटेट समाधान का उपयोग कर नमक एकाग्रता में वृद्धि से हटा रहे हैं । यह विधि एक बार में कई नमूनों को संभालने और प्रत्येक नमूने के लिए कई जीनोटाइप विश्लेषणों के लिए पर्याप्त डीएनए में पैदावार की अनुमति देती है।

पीसीआर कई आणविक प्रयोगशालाओं में एक आम तकनीक है। जबकि आम तौर पर परेशानी से मुक्त, वहां नुकसान है कि नकली परिणाम है, जो कहीं और22चर्चा की गई है उत्पादन प्रतिक्रिया जटिल हो सकता है । यहां प्रस्तुत पीसीआर की स्थिति खराब टेम्पलेट डीएनए गुणवत्ता के चेहरे में बहुत मजबूत दिखाई दी है, लेकिन खराब बुक्कल एपिथेलियल सेल हार्वेस्टिंग के कारण बेहद कम डीएनए सांद्रता के साथ टेम्पलेट्स का उपयोग करते समय पीसीआर प्रवर्धन की कमी फिर भी कभी-कभार देखी जाती थी । इस अध्ययन में इस्तेमाल डीएनए प्राइमर विभिन्न कंपनियों से आदेश दिया जा सकता है, जैसे कि इस कागज के अंत में सामग्री की मेज में उद्धृत । ऑपरेटर से DNases या डीएनए के साथ संदूषण से बचने के लिए डीएनए प्राइमर के साथ काम करते समय विशेष सावधानी बरती जानी चाहिए। पीसीआर उत्पादों को भी उपयोग में नहीं होने पर ठंडा रखना चाहिए।

एक और महत्वपूर्ण कदम एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस है। 16 बीपी की केवल एक दोहराने इकाई द्वारा भिन्न टुकड़े जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस में अलग नहीं किया जा सकता है और इस प्रकार एक बैंड के रूप में दिखाई देते हैं। इस मामले में, D1S80 alleles परीक्षण की दोहराने इकाइयों की संख्या का एक उचित निर्धारण का आश्वासन नहीं दिया जा सकता है । इसलिए, जेल के रन समय को बढ़ाया जाना चाहिए जबकि वोल्टेज को कम किया जाना चाहिए और एकल बैंड के बेहतर समाधान और अलगाव प्रदान करने के लिए जेल एकाग्रता को बढ़ाया जा सकता है।

यह उल्लेखनीय है कि वीएनटीआर लोकस के लिए सभी एलील्स में पूर्ण दोहराने वाली इकाइयां नहीं हैं। गैर-आम सहमति एलील्स (माइक्रोविएंट्स) जिनमें अपूर्ण दोहराने वाली इकाइयां होती हैं, अधिकांश वीएनटीआर लोकी में आम हैं और उनके आकार पूर्ण दोहराने वाली इकाइयों के साथ एलील्स के आकार के बीच में आते हैं। ये माइक्रोवेरिएंट एगरॉर्ज्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा बमुश्किल पता लगाया जा सकता है। इसके विपरीत , पॉलीएक्रीलामाइड जैल या केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस जैसी तकनीकें उन एलील्स को हल कर सकती हैं जो एक से कुछ दोहराने वाली इकाइयों या माइक्रोवेरेंट्स12,23,24,25, 26से भिन्न होती हैं । हालांकि, बाद की तकनीकें स्नातक प्रयोगशाला कक्षाओं के लिए कम उपयुक्त हैं क्योंकि उनके पास खतरनाक यौगिकों के उपयोग, जटिल तैयारी और उपकरणों की कमी सहित कई नुकसान हैं। टुकड़ा आकार निर्धारण के लिए, माइग्रेट डीएनए टुकड़ों की दूरी को मापते समय विशेष सावधानी बरती जानी चाहिए। यदि बैंड भी ठीक मापा जा करने के लिए फैलाना कर रहे हैं, रैखिक प्रतिगमन द्वारा D1S80 allele टुकड़ा आकार की गणना गलत हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप दोहराने इकाई संख्या का गलत अनुमान है । उस मामले में जेल की स्थिति को अनुकूलित करने के बाद एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का फिर से संचालन लोरेंज और सह-कार्यकर्ताओं द्वारा पहले वर्णित22के रूप में उचित है।

पूरे D1S80 VNTR विश्लेषण प्रक्रिया यहां प्रस्तुत, बुक्कल एपिथेलियल सेल संचयन से टुकड़ा लंबाई मूल्यांकन करने के लिए, एक ही कार्य दिवस में पूरा किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल स्नातक व्यावहारिक प्रयोगशाला कक्षाओं के लिए उपयुक्त एक मजबूत, लागत कुशल और उपयोग में आसान विधि है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को अपनी आवाज पर और सभी प्रतिभागियों को जो इस काम के लिए नमूने दान के लिए केविन ग्राहम शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 72,706 autoclaved
2 mL microcentrifuge tube Sarstedt 7,26,95,500 autoclaved
2-propanol Fisher chemical PI7508/17
5x PCR buffer Promega M7845
Acetic acid Sigma/Merck A6283-500ML
Agarose BioBudget 10-35-1020
Buccal swabs BioBudget 57-BS-05-600
Centrifuge Eppendorf 5430
Combs BioRad
dNTPs (10 mM) Invitrogen R0192
EDTA Carl Roth 8043.1
Ethanol Honeywell 32221-2.5L
Gel caster BioRad
Gel chamber BioRad SubCell GT
Gel Doc XR+ BioRad
Geltray BioRad SubCell GT
GeneRuler 50 bp DNA Ladder Thermo Fisher SM0371
Go-Taq Polymerase Promega M7845
Heating block Eppendorf Thermomixer 1.5 mL and 2 mL
Microwave Sharp R-941STW
peqGreen VWR  732-3196 
Pipettes Gilson 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL
Potassium acetate Arcos Organics 217100010
PowerPac power supply BioRad 100-120/220-240V
Primers Sigma/Merck
Scale Kern PCB 2.5 kg
SDS Arcos Organics 218591000
Shaker IKA labortechnik IKA RH basic
Tabletop centrifuge myFuge
Thermal Cycler BioRad C100 Touch
Tris VWR 103156x
Vortex mixer LMS VTX-3000L

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Siebers, M., Walla, A., Rütjes, T., Müller, M. F., von Korff, M. Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes. J. Vis. Exp. (173), e62305, doi:10.3791/62305 (2021).

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