הערכת מדדים תפקודיים של בריאות שריר השלד במיקרוטיסוסות שריר השלד האנושי
Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור מערכים של מיקרוטיסות שרירי השלד האנושיים בתלת-ממד ופולשניות מינימלית במורד הזרם בתקיפות תפקודיות, כולל כוח התכווצות ניתוחי טיפול בסידן.
Abstract
מודלים תלת-ממדיים (3D) במבחנה של שריר השלד הם התקדמות חשובה במחקר הביו-רפואי מכיוון שהם מאפשרים את ההזדמנות ללמוד רפורמציה בשרירי השלד ולתפקד במתכונת מדרגית הניתנת למניפולציות ניסיוניות. מערכות תרבית שרירים תלת-ממדיות רצויות מכיוון שהן מאפשרות למדענים לחקור את שרירי השלד אקס ויו בהקשר של תאים אנושיים. מודלים במבחנה תלת-ממדית מחקים מקרוב היבטים של מבנה הרקמה המקומי של שריר השלד הבוגר. עם זאת, היישום האוניברסלי שלהם מוגבל על ידי הזמינות של פלטפורמות כי הם פשוטים לפברק, עלות וידידותי למשתמש, ולהניב כמויות גבוהות יחסית של רקמות שריר השלד האנושי. בנוסף, מכיוון ששריר השלד ממלא תפקיד תפקודי חשוב הפוגע לאורך זמן במדינות מחלה רבות, פלטפורמה ניסיונית למחקרי מיקרוטיסו היא המעשית ביותר כאשר מדידות כוח סידן חולפות וצמצמות זעיר פולשניות יכולות להתבצע ישירות בתוך הפלטפורמה עצמה. בפרוטוקול זה, ייצור של פלטפורמה 96-well המכונה ‘MyoTACTIC’, וייצור המוני של microtissues שריר השלד האנושי 3D (hMMTs) מתואר. בנוסף, השיטות ליישום זעיר פולשני של גירוי חשמלי המאפשר מדידות חוזרות ונשנות של כוח שריר השלד וטיפול בסידן של כל מיקרוטיסה לאורך זמן מדווחות.
Introduction
שריר השלד הוא אחת הרקמות הנפוצות ביותר בגוף האדם ותומך בתפקודי גוף מפתח כגון קטר, הומאוסטזיס חום ומטבוליזם1. מבחינה היסטורית, מודלים של בעלי חיים ומערכות תרבית תאים דו-ממדיות (2D) שימשו לחקר תהליכים ביולוגיים ופתוגנזה של מחלות, כמו גם לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות בטיפול במחלות שרירי השלד2,3. בעוד מודלים של בעלי חיים שיפרו מאוד את הידע שלנו על שרירי השלד בבריאות ובמחלות, השפעתם התרגומית נפגעה על ידי עלויות גבוהות, שיקולים אתיים והבדלים בין המינים2,4. בפנייה למערכות מבוססות תאים אנושיים כדי לחקור את שרירי השלד, מערכות תרבית תאים דו-פעמיות הן חיוביות בשל הפשטות שלהן. עם זאת, יש מגבלה. תבנית זו לעתים קרובות נכשלת לשחזר את התא-תא ואינטראקציות מטריצה חוץ תאית המתרחשות באופן טבעי בתוך הגוף5,6. במהלך השנים האחרונות, מודלים תלת ממדיים (תלת-ממדיים) של שרירי השלד התגלו כחלופה רבת עוצמה למודלים של בעלי חיים שלמים ומערכות תרבות דו-ממדיות קונבנציונליות על ידי מתן אפשרות למודלים של תהליכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ופתולוגית ex vivo7,8. ואכן, שפע של מחקרים דיווחו על אסטרטגיות למודל שריר השלד האנושי בפורמט תרבות תלת-ממדית ביו-ארטיפיאלית1. מגבלה אחת לרבים ממחקרים אלה היא שכוח פעיל כומת בעקבות הסרת רקמות השריר מפלטפורמות התרבות וההצמדה למתמר כוח, שהוא הרסני ומכאן מוגבל לשמש כנקודת קצה9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. אחרים עיצבו מערכות תרבות המאפשרות שיטות לא פולשניות למדידת כוח פעיל, אך לא כולן מקובלות על יישומים לבדיקת מולקולות תוכן גבוה7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת לפברק מיקרוטיסות שריר אנושי (hMMTs) בשריר השלד (Myo) microTissue Array סטייה כדי לחקור forCe (MyoTACTIC) פלטפורמה; התקן צלחת 96 היטב התומך בייצור בתפזורת של מיקרוטיסוסות שריר השלד30. שיטת ייצור הלוח MyoTACTIC מאפשרת ייצור של צלחת תרבות 96 טוב polydimethylsiloxane (PDMS) וכל התכונות המתאימות היטב בשלב יציקה אחד, לפיה כל באר דורשת מספר קטן יחסית של תאים להיווצרות microtissue. Microtissues שנוצר בתוך MyoTACTIC מכילים myotubes מיושר, מפוספס, רב גרעיני כי הם לשחזור מבאר לבאר של המכשיר, ועל ההתבגרות, יכול להגיב לגירויים כימיים וחשמליים במקום30. להלן, הטכניקה לייצור התקן לוח תרבות MyoTACTIC PDMS משכפול פוליאוריטן (PU), שיטה ממוטבת ליישום תאי אבות מיוגניים אנושיים מונצחים כדי לפברק hMMTs, ואת ההערכה התפקודית של ייצור כוח hMMT מהונדס תכונות טיפול בסידן מתוארים ונדונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מתאר שיטות לפברק ולנתח מודל תרבות hMMT תלת-ממדי שניתן ליישם במחקרים של ביולוגיה בסיסית של שרירים, מידול מחלות או לבדיקת מולקולות מועמדות. פלטפורמת MyoTACTIC ידידותית לעלות, קלה לייצור, ודורשת מספר קטן יחסית של תאים כדי לייצר מיקרוטיסות שרירי השלד. h hMMTs שנוצר בתוך פלטפורמת התרבות MyoTACTIC מ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות למוחמד אפשר, הבן אברהא, מוחסן אפשר-בקושלי וסאדה דאבודי על תרומתם להמצאת פלטפורמת התרבות המיומטקטית והקמת שיטות הייצור והניתוח המתוארות כאן. HL קיבלה מימון מתוכנית הכשרה של המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה (NSERC) במלגת הנדסה ויזמות של אוניברסיטת טורונטו וילדקט. PMG הוא יו”ר המחקר בקנדה בתיקון אנדוגני וקיבל תמיכה למחקר זה ממכון אונטריו לרפואה רגנרטיבית, רשת תאי הגזע, ומרפואה על ידי עיצוב, תוכנית מצוינות מחקר ראשונה בקנדה. דיאגרמות סכמטיות נוצרו באמצעות BioRender.com.
Materials
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma – Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma – Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma – Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma – Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 – 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma – Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope – Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma – Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma – Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma – Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at – 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
Referências
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
- Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
- DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
- Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
- Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
- Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
- Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
- Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
- Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
- Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
- Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
