여기서는 전형염색 접근법과 결합된 전 생체 내 인간의 피부를 사용하여 상처 수리를 평가하기 위한 최적화된 기술을 시연합니다. 이 방법론은 잠재적인 상처 치료의 평가를 위한 전임상 플랫폼을 제공합니다.
주로 노인과 당뇨병에 영향을 미치는 만성 비 치유 상처는 임상 충족되지 않은 필요성의 중요한 영역입니다. 불행히도, 현재 만성 상처 치료는 부적당하지만, 사용 가능한 전 임상 모델은 새로운 치료법의 임상 효능을 제대로 예측하지 못하고 있습니다. 여기에서 우리는 인간 피부 복구 반응의 다중 양상을 평가하기 위하여 높은 처리량, 전임상 모형을 기술합니다. 부분 두께 상처는 인간 전 생체 내 피부에서 생성되고 치유 시간 과정을 통해 배양되었습니다. 피부 상처 생검은 전체 마운트 염색 절차에 대한 고정에서 수집되었다. 고정 된 샘플은 형광으로 접합 된 이차 항체를 통해 검출이 이루어지면서 1 차 항체에서 차단되고 배양되었습니다. 상처는 각 생검에서 백분율 상처 폐쇄 (재상화)를 계산하기 전에 공초점 현미경 검사를 통해 반염색되고 심상화되었습니다. 이 프로토콜을 적용, 우리는 건강한 기증자 피부에 생성 된 2mm 절제 적 상처가 완전히 4-5 후 상처 에 의해 다시 상형화되어 있음을 알 수 있습니다. 반대로, 당뇨병 피부 상처의 폐쇄 비율은 크게 감소, 혼란 장벽 개혁과 함께. 인간의 피부 상처와 새로운 전산 염색 접근법을 결합하면 전 생체 내 상처 수리를 정량화하는 신속하고 재현 가능한 방법이 있습니다. 전체적으로, 이 프로토콜은 잠재적인 상처 치료의 효과를 평가하기 위하여 귀중한 인간 적인 플랫폼을 제공합니다, 전 임상 시험 및 검증을 변환합니다.
노인과 당뇨병 환자에서 매우 널리 퍼진 만성, 비 치유 상처는 임상 충족되지 않은 필요성의 주로 인정받지 못하는 지역입니다. 이러한 상처는 환자에게 큰 신체적, 심리적 부담을 주며 매년1을치료하기 위해 의료 서비스 제공자에게 수십억 달러의 비용을 부담합니다. 상처 생물학과 기술의 발전에 대한 이해가 향상되더라도, 만성 상처의 최대 40%는 여전히 최고의 표준 배려2에따라 치유하는 것을 실패합니다. 따라서, 당뇨병 발 궤양을 가진 환자의 14-26%는 이후에 절단3를요구합니다, 5 년 사후 절단 사망률은 대략 70%4에서 있는 동안. 그 결과, 가난한 치유 상처에 의해 부과되는 실질적인 헬스케어 부담을 감소시키면서 환자의 삶의 질을 향상시키기 위하여 효과적인 새로운 치료를 개발하는 긴급한 요구 사항이 있습니다. 제대로 예측 전 임상 모델은 효과적인 새로운 치료의 개발에 중요한 장애물 남아있다.
상처 복구는 다양한 범위의 세포 유형, 수많은 수준의 통신 및 일시적으로 리모델링되는 조직 환경을 포함하는 동적이고 다각적인 과정입니다. 피부 치유는 4개의 중요한 회복 단계에 의해 뒷받침됩니다: hemostasis, 염증, 증식 및 매트릭스 리모델링. 이러한 단계는 궁극적으로 혈액 손실 및 감염을 방지하고 상처 표면 (재상화이라고 불리는 과정)을 닫고 피부를 부상되지 않은 상태로 되돌리기 위해 작용합니다5. 만성 상처는 다양한 병인학 및 치유 과정에 광범위한 동요와 연관되어6,치료 대상의 식별을 더욱 복잡하게. 그럼에도 불구하고, 상처 병리학의 분자 및 세포 동인을 해명하고 새로운 치료 접근법7을테스트하기 위해 광범위한 모델이 개발되었다.
가장 많이 사용되는 상처 수리 모델은 마우스에 급성 상처입니다. 마우스는 기계학 연구를 위해 높게 관예하고 노화와 당뇨병의 검증된 모형을 제공합니다8. 마우스와 인간의 치유 사이에 나타난 일반적인 유사성에도 불구하고 피부 구조와 치유 역학의 종 간 차이는 남아 있습니다. 이것은 대부분의 뮤린 상처 연구가 쉽게 클리닉9로번역되지 않는다는 것을 의미합니다. 결과적으로, 높은 적용성 및 번역성10,11을가진 체외 및 전 생체 시스템에서 인간을 향한 추진이 있었다.
여기서 우리는 전 생체 내 인간의 피부에 부분 두께 절제적 상처를 수행하기위한 심층 프로토콜을 제공합니다. 또한 전형염색 접근법을 전 생체 인간 피부 치유를 평가하는 매우 재현 가능한 방법으로 설명합니다. 우리는 표피 수리의 궤적을 보여줍니다 (다시 상피화) 및 후속 장벽 형성, 당뇨병 인간의 피부 대 건강한 상처 폐쇄의 비율을 평가. 마지막으로, 전체 탈것이 다양한 항체와 함께 사용하기 위해 어떻게 적응할 수 있는지 를 입증하여 치유 반응의 다양한 측면을 평가합니다.
이 실험 프로토콜에서, 우리는 전체 마운트 조직 염색을 사용하여 인간 전 생체 피부의 상처 폐쇄를 평가하기위한 최적화 된 방법을 설명합니다. 이것은 잠재적인 상처 처리의 중요한 평가를 허용하고, 인간 적인 상처 복구 반응의 더 나은 이해를 제공하기 위하여 중요한 자원입니다. 우리는 이전에 전 생체 피부 상처에 치유 평가를 발표했다12,13,아직 이러한 보고서에서 전체 마운트 염색 접근 방식은 상처 폐쇄를 측정하는 데 사용되지 않았다. 전체 마운트 염색은 훨씬 쉽고 파라핀 또는 OCT 포함 및 샘플의 단면을 포함하는 표준 히스토로지보다 덜 기술적 인 경험이 필요합니다. 또한 전체 마운트 절차는 실험 적 가변성을 감소시켜 조직 내의 정의된 위치에서 단일 횡방향 섹션뿐만 아니라 전체 상처의 정량화를 허용합니다 (비교 그림에 대한 그림 4B 참조). 우리는 완전히 전체 비 대칭 상처 구조의 치유의 중요성을 지원, 명확하게 뮤린 급성 상처에 대한 레아와 던발트에 의해 설명된 대로(14). 이 저자는 상처 형태학의 재현 가능하고 정확한 측정을 위한 생체 내 절제적 상처에서 연속적으로 단면의 중요성을 보여주었습니다. 직렬 단면은 인간 전 생체 내 상처에 동일하게 적용될 수 있습니다. 그러나, 상처 폐쇄 및 재상화의 정확한 정량화를 위해, 높은 처리량 전체 마운트 염색이 바람직한 방법이어야 한다. 이 전체 마운트 염색 프로토콜은 기존의 조직학적 분석을 위해 후속 처리(왁스 또는 OCT)와도 호환되어야 합니다.
전체 마운트 염색은 단점이없는 것은 아닙니다. 상처 치유 실험에서 더 높은 재현성을 제공하지만 표준 조직학적 기술보다 분석을 위해 더 많은 조직을 사용해야 합니다. 이것은 조직 접근이 제한되는 문제점일지도 모릅니다, 특히 다중 항체가 평가될 필요가 있는 곳에. 다른 접근법은 상처 폭이 상대적으로 균일하고 가변성이 감소되는 절개 상처 방법을 사용하는 것입니다 (마우스 및 인간의 상처에 도시된 바와 같이15,16). 그러나, 절제상처는 대부분의 병리학적 상처유형(17)에더 적용가능한 상태로 남아 있다.
이 연구에서는, 2mm 부분 두께 상처는 6mm 피부 이성의 중앙 내에서 만들어졌습니다. 이 방법은 다른 피부깊이(18)에서대체 절제상처 및 절제크기에 최적화될 수 있다. 또한, 상처를 생성하는 데 필요한 힘은 노인 피부가 생검에 적은 힘을 필요로 하는 기증자 마다 다를 것입니다. 우리는 또한 눈에 띄는 스트레치 마크 또는 기타 구조적 변화를 표시하는 피부를 사용하지 않을 것입니다. 우리는 전 생체 치유 반응의 다른 측면을 고려하는 항체의 범위를 검증했다. 이 프로토콜은 또한 항체 농도 및 잠복 시간이 최적화될 필요가 있는 그밖 피부 관련 항체와 함께 이용될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 우리의 프로토콜이 관심의 특정 단백질의 공간 평가 뒤에 총 상처 폐쇄의 절대 적인 정량화에 가장 적합하다고 믿습니다. 전체 마운트는 조직 섹션의 표준 조직 분석대 면역 국소화의 감소된 분해능을 제공하지만 표준 2D 조직학에서 누락된 추가 3D 정보를 제공합니다.
생체 모델의 전 생체 피부와 생체 내 피부의 치유를 평가하는 한 가지 주의 사항은 전신 반응이 부족하다는 것입니다. 상처 수리의 중요한 양상은 염증 및 후속 조직 과립이며, 이는 혈관(19)에서염증 세포 및 내피 세포의 유입에 의해 발생합니다. 이러한 제한에도 불구하고, ex vivo 피부는 여전히 세포 기반 상처 분석보다 임상 치유의 더 나은 회수를 제공합니다. 일반적으로 체외 실험은 조직 배양 플라스틱에서 자란 단일 세포 유형 단층 또는 공동 배양을 포함하지만 ex vivo 피부는 세포 행동을 탐구하는 네이티브 환경을 제공합니다. 최근에는 인공 매트릭스와 분리된 피부세포(20,21)로부터실험실 환경에서 피부가 자라는 다수의 피부 등가 시스템이등장하고있다. 이 모형은 대부분의 시험관 내 접근 보다는 더 나은 인간의 피부를 모방하더라도, 그(것)들은 아직도 완전히 네이티브 조직 환경을 시뮬레이션하지 않으며 일반적으로 재보적으로 상해를 입기 위하여 너무 허약합니다. 또한, 우리(및 그 외)는 전 생체 내 인간 피부 조직이 상주 면역 세포를 유지한다는 것을 입증했으며, 이는 의심할 여지 없이22,23을수리하는 데 기여할 것이다. 향후 작업은 이제 후기 단계 치유 평가24에대한 전 생체 모델의 생존력과 면역 역량을 확장하는 데 중점을 두어야 한다. 한 가지 옵션은 조직 생존가능성을 연장하고 문화25에서최대 2주 동안 네이티브 스킨 아키텍처를 유지할 수 있는 유망한 장기 온-어칩 기술의 발전이다. Ex vivo 모델은 또한 호중구와 같은 면역 세포를 숙주조직(26)에 성공적으로 통합하거나 면역 반응을 유도하기 위해 항체로 숙주 조직을 주입함으로써 피부 염증 반응의 중요성을 고려하기시작했다( 27) 우리는 이러한 사실 인정이 미래에 더 세련되고 번역 가능한 방법의 개발을 위한 도로를 포장할 것으로 예상합니다.
상처 폐쇄를 측정하기 위해 전 생체 균 피부를 사용하는 주요 이점은 병리학 (예 : 당뇨병 또는 노인) 조직과 건강한 (예 : 비 당뇨병 환자)에서 치유율을 비교하는 능력입니다. 여기에서 우리는 재상화와 장벽 형성이 실제로 건강한 전 생체 내 상처 대 당뇨병에서 실제로 손상된다는 것을 보여주었습니다. 실제로, 이것은 노화와 당뇨병이 만성 상처 개발을 위한 주요 위험 요소인 병리학 적 수리의 전 임상 평가를 위한 경로를 제공한다1. 체외 병리학 적 모델은 노인 및 당뇨병 조직으로부터 분리 된 세포, 또는 고혈당을 모방하기 위해 높은 포도당에서 배양 된세포(28,29)와같은 존재하지만, 이러한 세포는 생체 내 미세 환경에서 제거된 후 신속하게 표현형을 잃을 수 있습니다. 외외 병리학 적 치유 환경의 중요한 구성 요소는 노화와 당뇨병(30)모두에서 변경되는 진피 매트릭스입니다. 실제로, 이 혼란 매트릭스는 거주자와 순진한 섬유 아세포31,32의행동에 영향을 미친다. 따라서, 그들의 호스트 조직 환경에서 세포를 공부의 중요성을 과소 평가 할 수 없다.
요약하자면, 우리의 프로토콜은 인간의 상처를 다시 상피화하고, 규제 요인을 탐구하고, 잠재적 인 치료법의 타당성과 효능을 테스트하는 중요한 플랫폼을 제공합니다12,13. 전임상 테스트는 여전히 생체 내 접근법이 필요하지만, 전 생체 인간 조직과 생체 내 뮤린 상처를 사용하는 결합 된 전략은 전 임상 경로를 개선하여 동물 사용을 감소시키면서 종 간 번역성을 증가시켜야합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 환자 조직을 제공 씨 파올로 Matteuci와 미스터 조지 스미스에게 감사드립니다. 우리는 또한 미스 앰버 로즈 스태퍼드조직 수집 및 실험실 시설을 제공하는 데이지 호소를 지원해 주셔서 감사합니다.
50 mL Falcon Tubes | Falcon | 352070 | For skin washing |
1.5 ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile) | Starlab | S1615-5510 | For whole-mount staining |
48-Well CytoOne Plate, TC-Treated | Starlab | CC7682-7548 | For whole-mount staining |
Acetic Acid Glacial | Fisher Chemical | A/0400/PB15 | Part of fixative |
Alkyltrimethylammonium Bromide | Sigma-Aldrich | M7635 | Part of fixative |
Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4] | Abcam | ab7817 | Stains blood vessels |
Anti-Collagen I Antibody | Abcam | ab34710 | Stains collagen |
Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002] | Abcam | ab7800 | Stains epidermis |
CD1A Antibody (CTB6) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5265 | Stains Langerhans cells |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 62247 | Counterstain for cell nuclei |
Falcon 60mm Petri dishes | Falcon | 353004 | Human ex vivo culture |
Fibronectin Antibody (EP5) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8422 | Stains fibronectin |
Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR | Fisher Chemical | F/1501/PB17 | Part of fixative |
Gauze Swabs | Medisave | CS1650 | To clean skin |
Gibco™ Antibiotic-Antimycotic Solution | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Human ex vivo culture |
Gibco DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960044 | Human ex vivo culture |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Human ex vivo culture |
Gibco HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170088 | Human ex vivo culture |
Gibco L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Human ex vivo culture |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | For immunoperoxidase staining |
ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | For image analysis |
Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody |
Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11012 | Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody |
Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | For viability assessment of tissue |
Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1×2 teeth | World Precision Instruments | 15917 | To create wounds |
Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 501264 | To create wounds |
Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 501263 | To remove adipose tissue |
Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified | Biolegend | 905201 | Stains epidermis |
Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified | Biolegend | 905301 | Stains epidermis |
LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | Discontinued | For fluorescent imaging |
Merck Millipore Absorbent pads | Merck Millipore | AP10045S0 | Human ex vivo culture |
Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters | Merck Millipore | HNWP04700 | Human ex vivo culture |
Normal Goat Serum Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | Animal serum used depends on secondary antibody |
Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P3619 | For wash buffer |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | For blocking buffer |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | Part of fixative |
Sterilisation Pouches | Medisave | SH3710 | To sterilise instruments |
Stiefel 2mm biopsy punches | Medisave | BI0500 | For partial thickness wound |
Stiefel 6mm biopsy punches | Medisave | BI2000 | For outer explant |
Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | To prepare skin |
Triton X-100 | Fisher Chemical | T/3751/08 | For wash buffer |
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody |
Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories | SK-4800 | For immunoperoxidase staining |
Wireless Digital Microscope | Jiusion | N/A | For brightfield imaging |