Geavanceerd hartritmebeheer door toepassing van optogenetische multi-site fotostimulatie in muizenharten
Summary
Dit werk rapporteert een methode voor het regelen van het hartritme van intacte muizen van transgene channelrhodopsine-2 (ChR2) muizen met behulp van lokale fotostimulatie met een micro-LED-array en gelijktijdige optische mapping van epicardiale membraanpotentiaal.
Abstract
Ventriculaire tachyaritmieën zijn wereldwijd een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit. Elektrische defibrillatie met behulp van hoogenergetische elektrische schokken is momenteel de enige behandeling voor levensbedreigende ventriculaire fibrillatie. Defibrillatie kan echter bijwerkingen hebben, waaronder ondraaglijke pijn, weefselschade en verslechtering van de prognose, wat wijst op een significante medische behoefte aan de ontwikkeling van zachtere strategieën voor het beheer van het hartritme. Naast energiereducerende elektrische benaderingen, werd cardiale optogenetica geïntroduceerd als een krachtig hulpmiddel om hartactiviteit te beïnvloeden met behulp van lichtgevoelige membraanionkanalen en lichtpulsen. In de huidige studie zal een robuuste en geldige methode voor succesvolle fotostimulatie van Langendorff doordrenkte intacte muizenharten worden beschreven op basis van multi-site pacing met een 3 x 3 array van micro-light-emitting diodes (micro-LED). Gelijktijdige optische mapping van epicardiale membraanspanningsgolven maakt het mogelijk om de effecten van regiospecifieke stimulatie te onderzoeken en evalueert de nieuw geïnduceerde hartactiviteit direct ter plaatse. De verkregen resultaten tonen aan dat de werkzaamheid van defibrillatie sterk afhankelijk is van de parameters die zijn gekozen voor fotostimulatie tijdens een hartritmestoornis. Er zal worden aangetoond dat het verlichte gebied van het hart een cruciale rol speelt voor het succes van beëindiging en hoe de gerichte controle van hartactiviteit tijdens verlichting voor het wijzigen van aritmiepatronen kan worden bereikt. Samenvattend biedt deze techniek de mogelijkheid om de manipulatie van het mechanisme ter plaatse te optimaliseren op weg naar real-time feedbackcontrole van het hartritme en, met betrekking tot de regiospecificiteit, nieuwe benaderingen om de potentiële schade aan het hartsysteem te verminderen in vergelijking met het gebruik van niet-specifieke elektrische schoktoepassingen.
Introduction
Vroege onderzoeken van de ruimtelijk-temporele dynamiek tijdens aritmie onthulden dat de complexe elektrische patronen tijdens hartfibrilleren worden aangedreven door vortexachtige roterende excitatiegolven1. Deze bevinding gaf nieuwe inzichten in de onderliggende mechanismen van aritmieën, wat vervolgens leidde tot de ontwikkeling van nieuwe elektrische beëindigingstherapieën op basis van multi-site excitatie van het myocard 2,3,4. Behandelingen met behulp van elektrische veldstimulatie zijn echter niet-lokaal en kunnen alle omliggende prikkelbare cellen innerveren, inclusief spierweefsel, wat cellulaire en weefselschade veroorzaakt, evenals ondraaglijke pijn. In tegenstelling tot elektrische therapieën bieden optogenetische benaderingen een specifieke en weefselbeschermende techniek voor het oproepen van cardiomyocytenactiepotentialen met een hoge ruimtelijke en temporele precisie. Daarom heeft optogenetische stimulatie het potentieel voor minimale invasieve controle van de chaotische activeringspatronen tijdens hartfibrilleren.
De introductie van het lichtgevoelige ionkanaal channelrhodopsine-2 (ChR2) in prikkelbare cellen via genetische manipulatie 5,6,7, maakte de depolarisatie van het membraanpotentiaal van exciteerbare cellen mogelijk met behulp van fotostimulatie. Verschillende medische toepassingen, waaronder de activering van neuronale netwerken, de controle van hartactiviteit, het herstel van het gezichtsvermogen en het gehoor, de behandeling van ruggenmergletsels en andere 8,9,10,11,12,13,14 zijn ontwikkeld. De toepassing van ChR2 in de cardiologie heeft een aanzienlijk potentieel vanwege de milliseconde responstijd15, waardoor het zeer geschikt is voor de gerichte controle van aritmische hartdynamiek.
In deze studie wordt multi-site fotostimulatie van intacte harten van een transgeen muismodel getoond. Samenvattend werd een transgene alfa-MHC-ChR2-muislijn opgericht in het kader van het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) en vriendelijk verstrekt door prof. S. E. Lehnart. Over het algemeen werden transgene volwassen mannelijke C57/B6/J, die Cre-recombinase onder controle van alfa-MHC tot expressie brachten, gekoppeld om te paren met vrouwelijke B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Omdat de cardiale STOP-cassette in de tweede generatie werd verwijderd, vertoonden de nakomelingen een stabiele MHC-ChR2-expressie en werden ze gebruikt om cardiale lichtgevoelige kolonies in stand te houden. Alle experimenten werden gedaan met volwassen muizen van beide geslachten op een leeftijd van 36 – 48 weken. De verlichting wordt bereikt met behulp van een 3 x 3 micro-LED-array, vervaardigd zoals beschreven in 16,17, behalve dat de op silicium gebaseerde behuizing en de korte optische glasvezels niet zijn geïmplementeerd. Het eerste gebruik in een cardiale toepassing wordt gevonden in18. Een lineaire micro-LED-array op basis van een vergelijkbare fabricagetechnologie is toegepast als een penetrerende sonde voor hartpacing19. De micro-LED’s zijn gerangschikt in een 3 x 3 array met een pitch van 550 μm, wat zowel een hoge ruimtelijke resolutie als een hoog stralingsvermogen op een zeer klein gebied biedt. De auteurs demonstreren in dit werk een veelzijdige lokale multi-site fotostimulatie die het pad kan openen voor het ontwikkelen van nieuwe anti-aritmische therapiemethoden.
Het volgende experimentele protocol omvat een retrograde Langendorff-perfusie ex vivo, waarvoor de gecannuleerde aorta functioneert als perfusie-inlaat. Door de toegepaste perfusiedruk en de hartcontractie stroomt het perfusaat door de kransslagaders, die zich vertakken van de aorta. In het gepresenteerde werk wordt het hart doordrenkt met behulp van een constante drukopstelling die wordt bereikt door de perfusaatreservoirs te verhogen tot 1 m hoogte, wat overeenkomt met 73,2 mmHg, wat resulteert in een stroomsnelheid van 2,633 ± 0,583 ml / min. Twee soorten Tyrode’s oplossing worden gebruikt als perfusaat tijdens het experiment. De oplossing van reguliere Tyrode ondersteunt een stabiel sinusritme, terwijl de oplossing van Low-K+ Tyrode wordt gemengd met Pinacidil om de inductie van aritmie in muizenharten mogelijk te maken. Het gebruik van een zeshoekig waterbad maakt de observatie van het hart door zes verschillende vlakke vensters mogelijk, waardoor de koppeling van verschillende optische componenten mogelijk is met minder vervorming door breking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een succesvolle behandeling van cardiale tachyaritmieën is de sleutel tot harttherapie. De biofysische mechanismen die ten grondslag liggen aan aritmie-initiatie, -bestendiging en -beëindiging zijn echter niet volledig begrepen. Daarom is cardiaal onderzoek gericht op het optimaliseren van elektrische schoktherapie naar een zachtere beëindiging van aritmieën, waardoor de kwaliteit van leven van patiënten 28,29,30,31 wordt verhoogd.<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Marion Kunze en Tina Althaus bedanken voor hun uitstekende technische ondersteuning tijdens experimenten. Het onderzoek dat tot de resultaten heeft geleid, heeft financiering ontvangen van het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap FP7/2007-2013 onder subsidieovereenkomstnummer HEALTH-F2-2009-241526. Ondersteuning werd ook geboden door het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek, DZHK e.V. (Project MD28), partnersite Goettingen, de Duitse Onderzoeksstichting CRC 1002 (project C03) en de Max Planck Society. Dit werk werd mede ondersteund door BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence gefinancierd door de Duitse Research Foundation (DFG, subsidienummer EXC 1086).
Materials
| Chemical Components | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
| BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
| Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
| Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
| Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
| Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
| Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
| Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
| Electrical Setup | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
| Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
| Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
| Hexagonal water bath | |||
| LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
| LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
| MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
| micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
| Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| micro-LED Array Components | |||
| Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
| Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
| Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
| LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
| Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
| Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
| Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
| Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
| Optical Mapping | |||
| Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
| Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
| Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
| Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25×36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
| Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
| Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks – LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
| LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs – Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
| Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
| Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
| Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
| Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
Referências
- Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
- Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
- Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
- Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
- Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
- Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
- Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
- Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
- Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
- Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. , 5252-5255 (2014).
- Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. , 162-165 (2015).
- Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light – From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. , 4832-4835 (2018).
- Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
- . mouser.de, LED Engin, [Online] Available from: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208 (2020)
- . thorlabs.com, thorlabs, [Online] Available from: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020)
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
- Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
- Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
- Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
- Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. , 345-348 (2010).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
- Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
- O’Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping – Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
- Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
- Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
- Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
- Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
- Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
- Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
- Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
- Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
- Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
- Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).
