Generación de un modelo tridimensional simplificado de piel en un chip en una plataforma microfluídica micromecanizado
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo tridimensional de piel simplificado e indiferenciado utilizando una plataforma microfluídica micromecanizado. Un enfoque de flujo paralelo permite la deposición in situ de un compartimento dérmico para la siembra de células epiteliales en la parte superior, todo controlado por bombas de jeringa.
Abstract
Este trabajo presenta una plataforma microfluídica nueva, rentable y confiable con el potencial de generar tejidos complejos de múltiples capas. Como prueba de concepto, se ha modelado una piel humana simplificada e indiferenciada que contiene un compartimento dérmico (estromal) y epidérmico (epitelial). Para ello, se ha desarrollado un dispositivo versátil y robusto, a base de vinilo dividido en dos cámaras, superando algunos de los inconvenientes presentes en los dispositivos microfluídicos basados en polidimetilsiloxano (PDMS) para aplicaciones biomédicas, como el uso de equipos costosos y especializados o la absorción de moléculas y proteínas pequeñas e hidrofóbicas. Además, se desarrolló un nuevo método basado en el flujo paralelo, que permite la deposición in situ de los compartimentos dérmico y epidérmico. La construcción de la piel consiste en una matriz de fibrina que contiene fibroblastos primarios humanos y una monocapa de queratinocitos inmortalizados sembrados en la parte superior, que posteriormente se mantiene en condiciones de cultivo dinámico. Esta nueva plataforma microfluídica abre la posibilidad de modelar enfermedades de la piel humana y extrapolar el método para generar otros tejidos complejos.
Introduction
Recientemente, se han realizado avances hacia el desarrollo y producción de modelos de piel humana in vitro para el análisis de la toxicidad de productos cosméticos y farmacéuticos1. Los investigadores de las industrias farmacéutica y de cuidado de la piel han estado utilizando animales, siendo los ratones los más comunes, para probar sus productos2,3,4,5. Sin embargo, la prueba de productos en animales no siempre es predictiva de la respuesta en humanos, lo que con frecuencia conduce a la falla del medicamento o efectos adversos en humanos y, en consecuencia, a pérdidas económicas5,6. El Reino Unido fue el primer país que prohibió el uso de animales para pruebas cosméticas en 1998. Más tarde, en 2013, la UE prohibió las pruebas y la aprobación de cosméticos en animales (Reglamento de Cosméticos de la UE nº 1223/2009)7.
Esta prohibición también está siendo considerada por otros países, como en ‘The Humane Cosmetics Act’ en los EE.UU.8. Además de las preocupaciones éticas, las diferencias anatómicas entre la piel animal y humana hacen que las pruebas en animales consuman mucho tiempo, sean costosas y, a menudo, ineficaces. Además, se espera que el tamaño del mercado global de pruebas de toxicología in vitro alcance los USD 26.98 mil millones para 20259. Por estas razones, existe la necesidad de desarrollar nuevos métodos y alternativas para esos estudios in vitro, como los modelos de piel humana de bioingeniería, que permitan realizar pruebas de seguridad y efectos tóxicos de cosméticos y medicamentos sin el uso de animales.
Hay dos tipos diferentes de modelos de piel humana disponibles comercialmente, in vitro. El primer tipo consiste en equivalentes epidérmicos estratificados que contienen múltiples capas de queratinocitos diferenciadores que se siembran en diferentes materiales. Algunos de ellos han sido aprobados por la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) y validados por el (Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (ECVAM) para pruebas de corrosión e irritación cutánea, como EpiDerm o SkinEthic10,11,12. El segundo tipo son equivalentes de piel completa con una capa de queratinocitos humanos diferenciadores sembrados en un andamio tridimensional (3D) que contiene fibroblastos, como T-Skin y EpiDerm-FT. Sin embargo, estos modelos se cultivan en condiciones estáticas, lo que los hace incapaces de representar con precisión las condiciones fisiológicas humanas.
El interés reciente se ha centrado en la generación in vitro de modelos de piel 3D en formatos de inserción de cultivo celular (CCI) con perfusión dinámica13,14,15, 16,17,18,19. Sin embargo, estos sistemas no pueden considerarse stricto sensu como microfluídica piel en chips según su definición clásica en el campo. La definición de Ingber para órganos en un chip establece que el órgano debe colocarse dentro de los canales microfluídicos, que es una condición que solo unos pocos dispositivos cumplen20,21. Skin-on-chips ha modelado hasta ahora epitelios en su mayoría simples como capas unicelulares y/o capas de células dérmicas separadas por una membrana porosa22,23. Aunque ha habido algunos avances en el modelado de la piel en sistemas microfluídicos16,24, actualmente no hay literatura que muestre un sistema de órgano en un chip que se ajuste a la definición de Ingber, capaz de producir una piel de múltiples capas in situ e incluir componentes epiteliales y estromales.
En este trabajo, se presenta una nueva plataforma microfluídica rentable, robusta y basada en vinilo para aplicaciones skin-on-a-chip. Esta plataforma fue producida por micromecanismo, lo que proporciona más simplicidad en el proceso de fabricación, así como una mayor flexibilidad y versatilidad en el diseño del dispositivo, superando algunas de las limitaciones de PDMS25. También se diseñó una forma de introducir una construcción de piel simplificada a través de un flujo paralelo controlado con bombas de jeringa. El flujo paralelo permite que dos fluidos con viscosidades muy diferentes (un tampón y un pre-gel de fibrina en este caso) se perfundan a través de un canal sin mezclarse entre sí. Como prueba de concepto, se introdujo en el dispositivo una construcción dermoepírmica que contenía fibroblastos incrustados en una matriz de fibrina que imitaba la dermis, sobre la cual se cargó una monocapa de queratinocitos para emular la epidermis indiferenciada. La altura del compartimento dérmico se puede modular modificando los caudales. La principal novedad de este trabajo, frente a los modelos22,26,27,28, 29descritosanteriormente, es el desarrollo de un constructo 3D dentro de una microcámara mediante microfluídica. Aunque este artículo presenta una piel indiferenciada simplificada, el objetivo a largo plazo es generar y caracterizar una construcción de piel totalmente diferenciada para demostrar su viabilidad y funcionalidad para fines de pruebas de medicamentos y cosméticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La motivación para desarrollar este método fue el deseo de modelar las enfermedades de la piel y estudiar los efectos de las terapias nuevas e innovadoras en una plataforma de alto rendimiento. Hasta la fecha, este laboratorio produce estos equivalentes dermo-epidérmicos mediante la fundición, ya sea manualmente o con la ayuda de la tecnología de bioimpresión 3D, el gel de fibrina con fibroblastos en una placa de inserción de cultivo celular y la siembra de los queratinocitos sobre ella. Una vez que los queratinoc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos sinceramente al Dr. Javier Rodríguez, a la Dra. María Luisa López, a Carlos Matellán y a Juan Francisco Rodríguez por sus sugerencias, discusiones y/o datos preliminares muy útiles. También agradecemos amablemente las contribuciones de Sergio Férnandez, Pedro Herreros y Lara Stolzenburg a este proyecto. Un agradecimiento especial a la Dra. Marta García por los hFB y hKC etiquetados con GFP. Finalmente, reconocemos la excelente asistencia técnica de Guillermo Vizcaíno y Angélica Corral. Este trabajo ha sido apoyado por el “Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid”, Proyecto S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Este trabajo también fue apoyado por el “Programa de excelencia”, Proyecto EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Materials
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | – | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
Referências
- McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
- Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).
- Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
- Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
- Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A. Pronko et al. Reply. Physical Review Letters. 86 (7-12), 1387 (2001).
- H.R.2858 – Humane Cosmetics Act. 114th Congress Available from: https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858 (2016)
- . Global in-vitro toxicology testing market report: size, share & trends analysis 2014-2015 Available from: https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share–trends-analysis-2014-2025-300704958.html (2018)
- Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. Tissue engineered human skin equivalents. Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).
- OECD. In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431. OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).
- Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients. International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).
- vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).
- Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
- Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents. Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).
- Wu, R., et al. Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function. Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).
- Materne, E. -. M., et al. The multi-organ chip – a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526 (2015).
- Schimek, K., et al. Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications. Bioengenharia. 5 (2), 43 (2018).
- Alberti, M., et al. Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing. Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature BIotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).
- Wufuer, M., et al. Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment. Scientific Reports. 6, 37471 (2016).
- Ramadana, Q., Ting, F. C. W. In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin. Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).
- Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898 (2020).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Huh, D. A human disease model of drug toxicity – induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice. Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).
- Beckwitt, C. H., et al. Liver ‘ organ on a chip ‘. Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).
- Poceviciute, R., Ismagilov, R. F. Human-gut-microbiome on a chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 500-501 (2019).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
- Escámez, M. J., et al. Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement. Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).
- Llames, S. G., et al. Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin. Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).
- Llames, S., et al. Clinical results of an autologous engineered skin. Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).
- Cubo, N., Garcia, M., del Cañizo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. 3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis. Biofabrication. 9 (1), 015006 (2016).
- Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip. Biomaterials. 116, 48-56 (2017).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535 (2016).
- Marx, U., et al. Human-on-a-chip’ developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man. Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation. Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- O’Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture. Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).
- Ren, K., Chen, Y., Wu, H. New materials for microfluidics in biology. Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).
