μTongue: Dil In Vivo için Mikroakışkan tabanlı fonksiyonel görüntüleme platformu
Summary
Makale, mikroakışkanları dildeki bir intravital görüntüleme penceresine entegre ederek fonksiyonel tat hücresi görüntüleme in vivo için μTongue (dil üzerinde mikroakışkanlar) cihazını tanıtmaktadır.
Abstract
İntravital floresan mikroskopi, canlı bir hayvanda çok hücreli dinamikleri incelemek için yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Ancak tat duyusal organda başarıyla kullanılmamıştır. μTongue, mikroakışkanları intravital dil görüntüleme penceresine entegre ederek, birden fazla şok tabancasına kontrollü maruz kalma altında vivo tat hücrelerinin güvenilir fonksiyonel görüntülerini sağlar. Bu yazıda, μTongue sistemini kullanmak için ayrıntılı bir adım adım prosedür sunulmuştur. Beş alt kategori vardır: lezzetli çözümlerin hazırlanması, mikroakışkan bir modülün kurulması, numune montajı, işlevsel görüntü verilerinin alınması ve veri analizi. μTongue kullanırken ortaya çıkabilecek pratik sorunları çözmek için bazı ipuçları ve teknikler de sunulmaktadır.
Introduction
Intravital floresan mikroskop, canlı dokular üzerindeki mekansal dinamikleri incelemek için yaygın olarak kullanılır. Araştırmacılar, biyolojik süreçlerin floresan sinyallerine belirli ve hassas dönüşümlerini sağlayan genetik olarak kodlanmış sensörler geliştiriyorlar – bu sensörler yaygın olarak bulunan floresan mikroskoplar kullanılarak kolayca kaydedilebilir1,2. Kemirgenlerdeki çoğu iç organ mikroskop kullanılarak araştırılmış olsa da, dile başarılı uygulaması henüz başarılı olmamıştır3.
Tat hücrelerinin kalsiyum görüntülemesi üzerine daha önceki çalışmalar, sirkülasyon tat tomurcukları 4,5,6elde etmek için bir dil dokusunu ince bölümlere ayırarak veya mantar formu tat tomurcukları elde etmek için tat epitelini soyarak ex vivo yapıldı7,8. Bu örneklerin hazırlanması kaçınılmaz olarak invazivdi, bu nedenle sinirlerin innervasyonu, geçirgenlik bariyerleri ve kan dolaşımı gibi doğal mikroçevreler büyük ölçüde pertüre edildi. İlk intravital dil görüntüleme penceresi 2015 yılında Choi ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir, ancak akışkan tastant uyaranların neden olduğu hareket ve optik eserler nedeniyle güvenilir fonksiyonel kayıt elde edilemedi9.
Son zamanlarda, mikroakışkanlar-on-a-language (μTongue)tanıtıldı 10. Bu cihaz, fare dilinde bir görüntüleme penceresi ile mikroakışkan bir sistemi entegre eder. Görüntüleme süresi boyunca sabit bir uyarıcı uyaran akışı elde edilerek, akışkan hareketten elde edilen eserler en aza indirilebilir (Şekil 1). Giriş porti bir dizi çok kanallı basınç kontrolörü tarafından beslenirken, çıkış bağlantı noktası 0,3 mL/ dk tutan bir şırınna pompasına bağlanır. Ek olarak, şok çözeltilerinin kırılma indekslerindeki farklılık nedeniyle oluşan optik eserler, kalsiyuma duyarsız bir gösterge (tdTomato) ve kalsiyum göstergesi (GCaMP6)11.’yitanıtan oranmetrik analiz ile en aza indirilmiştir. Bu tasarım, akışkan kanallar arasında ani geçişle bile tat hücrelerinin vivo mikroskobik stabilitesini sağladı. Sonuç olarak, μTongue, vivo fare tat tomurcuklarına birden fazla şok tabancasının güvenilir bir fonksiyonel taramasını uygular.
Bu protokolde, μTongue kullanılarak in vivo fare mantar formu tat tomurcuklarının kalsiyum görüntülemesi için deneysel prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İlk olarak, yapay tükürük ve lezzetli çözeltilerin hazırlanması açıklanmaktadır. İkinci olarak, yarı sabit durum akışını sağlamak için mikroakışkan sistemin kurulmasına geçilir. Üçüncü olarak, görüntü alımına izin vermek için fare dilini μTongue’a monte etmek için kullanılan prosedürler tanımlanmıştır. Son olarak, yanal hareket yapıtlarının ve oranmetrisinin düzeltilmesi de dahil olmak üzere görüntü analizi için her adım belirtilir. Bu protokol, bir fare tesisi ve iki foton mikroskobu veya eşdeğer bir ekipman ile herhangi bir araştırma laboratuvarına kolayca uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan, vivo tat hücrelerinin fonksiyonel faaliyetlerinin araştırılmasına μTongue uygulamak için ayrıntılı bir protokoldür. Bu protokolde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri kullanılarak tat hücreleri üzerinde fonksiyonel görüntüleme yapılmaktadır. Transgenik farelerin kullanımına ek olarak, kalsiyum boyalarının (veya voltaj algılama boyalarının) tat hücrelerine elektroforetik olarak yüklenmesi alternatif bir seçenek olabilir.
Bu …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi olan Temel Bilimler Enstitüsü (IBS-R015-D1) tarafından desteklenmiştir (Hayır. 2019M3A9E2061789) ve Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi (No. 2019M3E5D2A01058329). Eunsoo Kim ve Eugene Lee’ye teknik yardımları için minnettarız.
Materials
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
Referências
- Mao, T., O’Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
