Rettet differentiering af hæmogene endotelceller fra humane pluripotente stamceller

Summary

Præsenteret her er en simpel protokol til rettet differentiering af hæmogene endotelceller fra humane pluripotente stamceller i ca. 1 uge.

Abstract

Blodkar er allestedsnærværende fordelt i alle væv i kroppen og udfører forskellige funktioner. Således er afledning af modne vaskulære endotelceller, der linjer blodkar lumen, fra humane pluripotente stamceller afgørende for en lang række vævsteknik og regenereringsapplikationer. In vivo er primordiale endotelceller afledt af den mesodermale afstamning og er specificeret mod specifikke undertyper, herunder arterielle, venøse, kapillæriske, hæmogene og lymfatiske. Hæmogene endotelceller er af særlig interesse, fordi de under udviklingen giver anledning til hæmatopoietiske stam- og stamceller, som derefter genererer alle blodlinjer gennem hele livet. Oprettelse af et system til generering af hæmogene endotelceller in vitro ville således give mulighed for at studere endotel-til-hæmatopoietisk overgang og kan føre til ex vivo-produktion af humane blodprodukter og reduceret afhængighed af humane donorer. Mens der findes flere protokoller til afledning af stamceller og primordiale endotelceller, er generering af velkarakteriserede hæmogene endotelceller fra humane stamceller ikke blevet beskrevet. Her præsenteres en metode til afledning af hæmogene endotelceller fra humane embryonale stamceller på ca. 1 uge: en differentieringsprotokol med primitive streakceller dannet som reaktion på GSK3β-hæmmer (CHIR99021), derefter mesoderm-afstamningsinduktion medieret af bFGF, efterfulgt af primordial endotelcelleudvikling fremmet af BMP4 og VEGF-A og endelig hæmogen endotelcellespecifikation induceret af retinsyre. Denne protokol giver en veldefineret population af hæmogene endotelceller, der kan bruges til yderligere at forstå deres molekylære regulering og endotel-til-hæmatopoietisk overgang, som har potentialet til at blive anvendt til downstream terapeutiske anvendelser.

Introduction

Endotelceller (EC’er) er en heterogen population af celler, der udfører flere funktioner i hele menneskekroppen og i manipulerede væv. Ud over at understøtte og regulere andre celletyper (dvs. kardiomyocytter¹, osteoblastiske celler²) omfatter disse funktioner dannelse af en selektiv barriere mellem blod og væv og hjælp til vævsdannelse³. Differentiering af modne EC’er under normal udvikling kræver forskellige signalveje. Primordial EC’er er afledt af mesoderm forfædre og specificeres derefter mod modne arterielle, venøse, kapillære og lymfatiske fænotyper⁴. Derudover er en lille delmængde af EC’er i den ekstraembryonale æggeblomme sac og embryonale Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) region også specificeret til at blive hæmogene EC’er, som giver anledning til hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC’er), der migrerer til fosterleveren og føtal knoglemarv, hvor de forbliver postnatalt og genererer alle blodcelletyper gennem hele livet⁴. Den mangfoldige vifte af EF-fænotyper er afgørende for al vævsudvikling og vedligeholdelse.

EC’er og deres derivater er således kritiske komponenter i undersøgelser, der sigter mod modellering og belysning af mekanismer for menneskelig udvikling og / eller sygdom samt regenerativ medicin og vævstekniske applikationer 5,6,7,8. Den største begrænsning for denne type undersøgelser er imidlertid manglen på tilgængelighed af primære humane EC’er i den krævede mængde. Det anslås, at der vil være behov for mindst 3 x 10⁸ EC’er til de fleste terapeutiske anvendelser⁶. For at løse dette problem er brugen af humane embryonale stamceller (hESC’er) og humaninducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er) blevet foreslået på grund af deres forskellige afstamningspotentiale og deres evne til at generere et stort antal afkom ^6,9.

Faktisk er anvendeligheden af celler afledt af hESC’er eller hiPSC’er blevet demonstreret i flere undersøgelser med fokus på sygdomsmodellering og lægemiddelscreening^10,11,12. Organ-on-a-Chip (OOC) teknologi er blevet brugt til mere trofast at rekapitulere fysiologien i den menneskelige krop ved at integrere celler og væv i tredimensionelle stilladser. Desuden kan tilslutning af flere individuelle OOC’er (en såkaldt body- eller human-on-a-chip, BOC/HOC) opnås via mikrofluidik for at muliggøre krydstale mellem organerne^{af interesse 13,14,15}. Understøttende væv, såsom vaskulaturen, er kritiske komponenter i OOC’er og BOC / HOC’er; Inkorporering af vaskulatur muliggør transport af næringsstoffer, ilt og parakrine faktorer gennem vævene og derved fremmer det nødvendige vævsspecifikke mikromiljø ^3,12. Således er metoder til udledning af modne humane EC’er, såsom arterielle, venøse, lymfatiske og hæmogene EC’er, afgørende for at fremme disse vævstekniske tilgange.

Der er offentliggjort flere protokoller, der beskriver trin til afledning af menneskelige ur- eller stamfader-EC’er fra hESC’er eller hiPSC’er 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Mange af disse protokoller er afhængige af embryoid body (EB) dannelse eller co-kultur af ESC’er / iPSC’er med et murinføderlag af stromale celler. Disse strategier har tendens til at være vanskelige og tidskrævende med lave EF-udbytter og / eller forurening af humane EC’er med murinceller. Protokoller, der udelukkende er afhængige af 2D-kultur uden brug af stromale celler, kræver ofte lange induktioner, anvender komplekse kombinationer af vækstfaktorer og / eller hæmmere til induktion, har længere ekspansionsperioder efter celleseparation eller en kombination af disse faktorer. Øget viden om signalveje og faktorer, der er involveret i afledning af modne EF-typer in vivo, danner grundlaget for en enkel og robust in vitro-differentieringsprotokol.

Tidligere blev nøgleroller for Notch og Retinoic Acid (RA) signalveje i specifikationen af henholdsvis murine arterielle og hæmogene EC’er under udvikling identificeret. Notch-signalvejen spiller flere roller i specifikationen og vedligeholdelsen af den arterielle EC-fænotype. Arbejde ved hjælp af murine retinal vaskulariseringsmodel identificerede en vej, hvor væskeforskydningsspænding inducerer en Notch-Cx37-p27 signalakse, der fremmer G1-cellecyklusstop, hvilket muliggør arteriel EC-specifikation²⁷. Cellecyklustilstande er blevet antaget at spille en rolle i celleskæbnebeslutninger ved at give forskellige muligheder, hvor celler er modtagelige for visse signaler, der kan inducere genekspression og fænotypiske ændringer²⁸. Denne Notch-medierede G1-anholdelse muliggjorde ekspression af gener beriget i arterielle EC’er, herunder ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 og Notch 4 (gennemgået i^29,30). Det har også vist sig, at hæmogen EF-specifikation fremmes in vivo via RA-signalering^31,32. Yderligere undersøgelser identificerede, at nedstrøms for RA-signalering, ekspression af c-Kit og Notch opregulerer p27, hvilket muliggør hæmogen specifikation i murine æggeblommesækken og AGM³³. Murine hæmogene EC’er kan minimalt identificeres ved ekspression af både endotel (dvs. CD31, KDR) og hæmatopoietiske (dvs. c-Kit, CD34) markører⁴. Endelig gennemgår hæmogene EC’er en endotel-til-hæmatopoietisk overgang (EHT) til dannelse af HSPC’er, som kan give anledning til alle blodcelletyper 4,34,35.

Nyligt arbejde testede, om det samme signalhierarki kan fremme menneskelig hæmogen EF-specifikation. For at gøre dette blev der udviklet en serum- og feederfri 2D-kulturprotokol til at udlede hæmogene EC’er fra hESC’er, og disse hæmogene EC’er blev karakteriseret på et enkelt celleniveau som CD31 + KDR + c-Kit + CD34 ⁺ VE-Cadherin- CD45^–. Denne undersøgelse udnyttede også FUCCI-reporteren (Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator), som identificerer forskellige cellecyklustilstande ved hjælp af H9-hESC’er, der udtrykker FUCCI-reporterkonstruktionen (H9-FUCCI-hESC)³⁶. I undersøgelser med disse celler blev det påvist, at RA fremmer tidlig G1-cellecyklusstop i EC’er, og tidlig G1-tilstand muliggør hæmogen specifikation in vitro³⁷. Heri gives en detaljeret protokol til differentiering af disse humane hæmogene endotelceller og assays, der bekræfter deres identitet. Denne enkle metode giver et nyttigt middel til at generere denne specialiserede delmængde af EC’er til fremtidige undersøgelser af mekanismer for udvikling af humane blodlegemer.

Protocol

1. Forberedelse af reagenser og reagens BEMÆRK: En liste over reagenser findes i Materialefortegnelse. Få de humane pluripotente stamcellelinjer: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.BEMÆRK: Genereringen af hæmogene EC’er kan være mere effektiv i H1-cellelinjen. Forbered matrixproteinlagre: Aliquot matrixproteinet i forkølede 1,5 ml rør (på is), så hvert rør indeholder 1 mg matrixprotein. 1 mg matrixprotein er nok til at belægge alle brønde af to 6-brønd…

Representative Results

Figur 1 viser en skematisk beskrivelse af specifikationen af oprindelige EC’er og hæmogene EC’er fra hESC’er og et repræsentativt billede af celler 24 timer efter plettering. Efter specifikation er primordiale EC’er og hæmogene EC’er FACS-renset på henholdsvis dag 5 og 8. Primordial EC’er er defineret som CD31+ CD45- og hæmogene EC’er er defineret som CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-. En re…

Discussion

Heri skitseres trinene til fremstilling af hæmogene endotelceller fra humane embryonale stamceller på ca. 1 uge ved hjælp af et murinfoder- og serumfrit 2D-kultursystem (figur 1). Denne protokol udvider en metode beskrevet af Sriram et al. (2015) for at opnå primordial ECs³⁸. CD31⁺ CD45-EC’ernes oprindelige karakter og specifikationspotentiale demonstreres ved at dyrke disse celler på DLL4-belagte plader og observere ændringer i genekspress…

Materials

15 cm dishes	Corning	430599	tissue culture treated
35 mm dishes	Corning	430165	tissue culture treated
6-well plates	Corning	3516	tissue culture treated
Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin	Invitrogen	ant-nr-1
bFGF	R&D systems	233-FB-025	use at 50 ng/mL
BMP4	BioLegend	595202	use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-1
Cell Detatchment Solution Brand Name: vAccutase	Stemcell Technologies	7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650-100mL
Dispase	Stemcell Technologies	7913
DLL4	R&D systems	1506-D4/CF	recombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12	Gibco	11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190144
Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)	Lonza	CC-3162
FACS tubes	Corning	352235	polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio	100-106
Fibronectin	ThermoFisher Scientific	33016015	use at 4 mg/cm2
GSK3i/CHIR99021	Stemgent	04-0004-02	10 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175-095
Hydrochloric Acid (HCl)	Fisher Scientific	A144S-500
Matrix protein  Brand Name: Matrigel	Corning	356230	Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched	Stemcell Technologies	4435
Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2	Stemcell Technologies	5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI	WiCell	WA09 (H9), WA01 (H1)	human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)	Gibco	12040077
Retinoic Acid	Sigma Aldrich	R2625-50mg	use at 0.5 μM
Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix	BioRad	1708840
RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	SS255-1
Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1	Stemcell Technologies	85850
SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix	BioRad	1725121
Trypsin-EDTA	Gibco	25299956	0.25%
VEGF165 (VEGF-A)	PeproTech	100-20	use at 50 ng/mL
α-CD31-FITC	BioLegend	303104	2 μg/mL*
α-CD34-Pacific Blue	BioLegend	343512	2 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7	BioLegend	304014	2 μg/mL*
α-c-Kit-APC	BioLegend	313206	2 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7	BioLegend	359911	2 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PE	BioLegend	348506	2 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.