Les tranches pulmonaires coupées avec précision comme outil efficace pour les études ex vivo sur la structure et la contractilité des vaisseaux pulmonaires
Summary
Présenté ici est un protocole pour préserver la contractilité vasculaire du tissu pulmonaire murin PCLS, résultant en une image tridimensionnelle sophistiquée du système vasculaire pulmonaire et des voies respiratoires, qui peut être préservée jusqu’à 10 jours et qui est sensible à de nombreuses procédures.
Abstract
La visualisation du tissu pulmonaire murin fournit des informations structurelles et cellulaires précieuses concernant les voies respiratoires et le système vasculaire sous-jacent. Cependant, la préservation des vaisseaux pulmonaires qui représente vraiment des conditions physiologiques présente encore des défis. De plus, la configuration délicate des poumons murins entraîne des défis techniques dans la préparation d’échantillons pour des images de haute qualité qui préservent à la fois la composition cellulaire et l’architecture. De même, des tests de contractilité cellulaire peuvent être effectués pour étudier le potentiel des cellules à répondre aux vasoconstricteurs in vitro,mais ces tests ne reproduisent pas l’environnement complexe du poumon intact. Contrairement à ces problèmes techniques, la méthode de la tranche pulmonaire coupée avec précision (PCLS) peut être appliquée comme une alternative efficace pour visualiser le tissu pulmonaire en trois dimensions sans biais régional et servir de modèle de contractilité de substitution vivant jusqu’à 10 jours. Les tissus préparés à l’aide de PCLS ont conservé la structure et l’orientation spatiale, ce qui les rend idéaux pour étudier les processus pathologiques ex vivo. L’emplacement des cellules endogènes tdTomato-marqué dans le PCLS récoltées à partir d’un modèle murin tdTomato reporter inductible peut être visualisé avec succès par microscopie confocale. Après exposition à des vasoconstricteurs, le PCLS démontre la préservation de la contractilité des vaisseaux et de la structure pulmonaire, qui peuvent être capturées par un module time-lapse. En combinaison avec les autres procédures, telles que le transfert de Western et l’analyse de l’ARN, le PCLS peut contribuer à la compréhension globale des cascades de signalisation qui sous-tendent une grande variété de troubles et conduire à une meilleure compréhension de la physiopathologie dans les maladies vasculaires pulmonaires.
Introduction
Les progrès dans la préparation et l’imagerie du tissu pulmonaire qui préserve les composants cellulaires sans sacrifier la structure anatomique fournissent une compréhension détaillée des maladies pulmonaires. La capacité d’identifier les protéines, l’ARN et d’autres composés biologiques tout en maintenant la structure physiologique offre des informations vitales sur l’arrangement spatial des cellules qui peuvent élargir la compréhension de la physiopathologie dans de nombreuses maladies pulmonaires. Ces images détaillées peuvent conduire à une meilleure compréhension des maladies vasculaires pulmonaires, telles que l’hypertension artérielle pulmonaire, lorsqu’elles sont appliquées à des modèles animaux, ce qui peut conduire à des stratégies thérapeutiques améliorées.
Malgré les progrès technologiques, l’obtention d’images de haute qualité du tissu pulmonaire murin reste un défi. Le cycle respiratoire est entraîné par une pression intrathoracique négative générée lors de l’inhalation1. Lors de l’obtention traditionnelle de biopsies et de la préparation d’échantillons pulmonaires pour l’imagerie, le gradient de pression négative est perdu, ce qui entraîne l’effondrement des voies respiratoires et du système vasculaire, qui ne se représente plus dans son état actuel. Pour obtenir des images réalistes reflétant les conditions actuelles, les voies respiratoires pulmonaires doivent être regonflées et le système vasculaire perfusé, transformant le poumon dynamique en un luminaire statique. L’application de ces techniques distinctes permet de préserver l’intégrité structurelle, le système vasculaire pulmonaire et les composants cellulaires, y compris les cellules immunitaires telles que les macrophages, ce qui permet de voir le tissu pulmonaire aussi près que possible de son état physiologique.
Le tranchage pulmonaire coupé avec précision (PCLS) est un outil idéal pour étudier l’anatomie et la physiologie du système vasculaire pulmonaire2. PCLS fournit une imagerie détaillée du tissu pulmonaire en trois dimensions tout en préservant les composants structurels et cellulaires. Le PCLS a été utilisé dans des modèles animaux et humains pour permettre des images vivantes et à haute résolution des fonctions cellulaires en trois dimensions, ce qui en fait un outil idéal pour étudier des cibles thérapeutiques potentielles, mesurer la contraction des petites voies respiratoires et étudier la physiopathologie des maladies pulmonaires chroniques telles que la MPOC, la MFI et le cancer du poumon3. En utilisant des techniques similaires, l’exposition d’échantillons de PCLS à des vasoconstricteurs peut préserver la structure pulmonaire et la contractilité des vaisseaux, reproduisant ainsi des conditions in vitro. En plus de préserver la contractilité, les échantillons préparés peuvent subir des analyses supplémentaires telles que le séquençage de l’ARN, le transfert Western et la cytométrie en flux lorsqu’ils sont préparés correctement. Enfin, les cellules marquées par couleur rapporteur marquées avec la fluorescence tdTomato après la récolte pulmonaire peuvent préserver l’étiquetage après la préparation des microselices, ce qui le rend idéal pour les études de suivi cellulaire. L’intégration de ces techniques fournit un modèle sophistiqué préservant l’arrangement spatial des cellules et la contractilité des vaisseaux qui peut conduire à une compréhension plus détaillée des cascades de signalisation et des options thérapeutiques potentielles dans la maladie vasculaire pulmonaire.
Dans ce manuscrit, le tissu pulmonaire murin PCLS est exposé à des vasoconstricteurs, démontrant une intégrité structurelle préservée et une contractilité des vaisseaux. L’étude démontre que les tissus préparés et manipulés de manière appropriée peuvent rester viables pendant 10 jours. L’étude démontre également la préservation des cellules à fluorescence endogène (tdTomato), permettant aux échantillons de fournir des images à haute résolution du système vasculaire pulmonaire et de l’architecture. Enfin, des moyens de manipuler et de préparer des tranches de tissu pour la mesure de l’ARN et le transfert Western pour étudier les mécanismes sous-jacents ont été décrits.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, une méthode améliorée pour produire des images à haute résolution du tissu pulmonaire murin qui préserve la structure vasculaire et optimise la flexibilité expérimentale est décrite, en utilisant spécifiquement l’application de PCLS pour obtenir des microslices de tissu pulmonaire qui peuvent être visualisés en trois dimensions avec une contractilité préservée du système vasculaire. En utilisant le réactif de viabilité, le protocole démontre que des tranches soigneusement préparé…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les Drs Yuan Hao et Kaifeng Liu pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par un NIH 1R01 HL150106-01A1, la bourse Parker B. Francis et le prix de recherche Aldrighetti de l’Association pour l’hypertension pulmonaire au Dr Ke Yuan.
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
Referências
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