Corte de precisão Fatias pulmonares como uma ferramenta eficiente para ex vivo estrutura de vasos pulmonares e estudos de contratibilidade

Summary

Apresentado aqui é um protocolo para preservar a contração vascular do tecido pulmonar murino PCLS, resultando em uma imagem tridimensional sofisticada da vasculatura pulmonar e das vias aéreas, que pode ser preservada por até 10 dias suscetíveis a inúmeros procedimentos.

Abstract

A visualização do tecido pulmonar murino fornece informações estruturais e celulares valiosas sobre as vias aéreas subjacentes e a vasculatura. No entanto, a preservação de vasos pulmonares que realmente representam condições fisiológicas ainda apresenta desafios. Além disso, a delicada configuração dos pulmões murinos resulta em desafios técnicos na preparação de amostras para imagens de alta qualidade que preservam tanto a composição celular quanto a arquitetura. Da mesma forma, ensaios de contrailidade celular podem ser realizados para estudar o potencial das células para responder aos vasoconstritores in vitro,mas esses ensaios não reproduzem o ambiente complexo do pulmão intacto. Em contraste com essas questões técnicas, o método de corte de precisão da fatia pulmonar (PCLS) pode ser aplicado como uma alternativa eficiente para visualizar o tecido pulmonar em três dimensões sem viés regional e servir como um modelo de contração de substituto vivo por até 10 dias. Tecido preparado com PCLS tem estrutura preservada e orientação espacial, tornando-se ideal para estudar processos de doença ex vivo. A localização de células etiquetadas tdTomato endógenas em PCLS colhidas a partir de um modelo de murina tdTomato indutível pode ser visualizada com sucesso por microscopia confocal. Após a exposição aos vasoconstritores, o PCLS demonstra a preservação tanto da contração do vaso quanto da estrutura pulmonar, que pode ser capturada por um módulo de lapso de tempo. Em combinação com os outros procedimentos, como a análise da mancha ocidental e do RNA, o PCLS pode contribuir para a compreensão abrangente das cascatas sinalizadoras que sustentam uma ampla variedade de distúrbios e levam a uma melhor compreensão da fisiopatologia em doenças vasculares pulmonares.

Introduction

Avanços na preparação e imagem do tecido pulmonar que preserva componentes celulares sem sacrificar a estrutura anatômica fornecem uma compreensão detalhada das doenças pulmonares. A capacidade de identificar proteínas, RNA e outros compostos biológicos, mantendo a estrutura fisiológica, oferece informações vitais sobre o arranjo espacial das células que podem ampliar a compreensão da fisiopatologia em inúmeras doenças pulmonares. Essas imagens detalhadas podem levar a uma melhor compreensão de doenças vasculares pulmonares, como a hipertensão arterial pulmonar, quando aplicadas a modelos animais, potencialmente levando a melhores estratégias terapêuticas.

Protocol

Todos os cuidados com animais estavam de acordo com as diretrizes do Hospital Infantil de Boston e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou protocolos. Os camundongos utilizados neste estudo são ratos do tipo selvagem C57/B6 e camundongos cruzados Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.

1. Preparação de soluções

1. Prepare a solução tampão fosfato (1x PBS) e a solução de 2% de agarose necessária durante o experimento com antecedência.
   1. Misture 2 g de pó de agarose em 100 mL de água autoclavada. Aqueça-o no micro-ondas alguns segundos de cada vez até que a solução esteja clara.
   2. Coloque a solução em um banho....

Results

Quando adicionado às células ou tecidos, o reagente de viabilidade é modificado pelo ambiente redutor do tecido viável e fica rosa/vermelho, tornando-se altamente fluorescente. As alterações de cor representativas detectadas a partir do dia 0-1 e do dia 9-10 são demonstradas na Figura 3. Como observado, a solução começou azul e ficou rosa da noite para o dia, demonstrando viabilidade. A mudança de cor normalmente ocorre dentro de 1-4 h; no entanto, um tempo maior pode ser necessário. Para av.......

Discussion

Neste manuscrito, descreve-se um método aprimorado para produzir imagens de alta resolução do tecido pulmonar murino que preserva a estrutura vascular e otimiza a flexibilidade experimental, utilizando especificamente a aplicação do PCLS para obter microsapos de tecido pulmonar que podem ser visualizados em três dimensões com contrariedade preservada da vasculatura. Usando o reagente de viabilidade, o protocolo demonstra que fatias cuidadosamente preparadas e preservadas podem reter viabilidade por mais de uma semana. A .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5cc de heparina fracionada em seringa	BD	100 unidades USP por mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 polegada calibre agulha de extremidade romba para canulação de traqueia	Cml Supply	90120050D
30cc seringa	BD	309650
Anti solução	Gibco	15240096
Micrótomo de lâmina vibratória automatizada	Leica	VT1200S
Reagente de viabilidade celular (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco' s Modified Eagle Medium e GLutaMAX, suplementado com 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Almofariz e pilão	Amazon
RIPA lise e tampão de extração	Thermoscientific	89900
Sutura cirúrgica 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagente	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Baixo Ponto de Fusão Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Conjunto de coleta de sangue alado (agulha borboleta) 25-30G	BD	25-30G