यहां प्रस्तुत पीसीएलएस मुरीन फेफड़ों के ऊतकों की संवहनी संकुचन के संरक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल है, जिसके परिणामस्वरूप फेफड़े के संवहनी और वायुमार्ग की एक परिष्कृत त्रि-आयामी छवि होती है, जिसे 10 दिनों तक संरक्षित किया जा सकता है जो कई प्रक्रियाओं के लिए अतिसंवेदनशील है।
मुरीन फेफड़ों के ऊतकों का दृश्य अंतर्निहित वायुमार्ग और वाक्यूलेचर के बारे में मूल्यवान संरचनात्मक और सेलुलर जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, फेफड़े के जहाजों का संरक्षण जो वास्तव में शारीरिक स्थितियों का प्रतिनिधित्व करता है, अभी भी चुनौतियां प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, मुरीन फेफड़ों के नाजुक विन्यास के परिणामस्वरूप तकनीकी चुनौतियां उच्च गुणवत्ता वाली छवियों के लिए नमूने तैयार कर रही हैं जो सेलुलर संरचना और वास्तुकला दोनों को संरक्षित करते हैं। इसी तरह, सेलुलर संकुचन परख को विट्रो मेंवासोकॉन्स्ट्रिकर्स का जवाब देने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन ये परख बरकरार फेफड़ों के जटिल वातावरण को पुन: पेश नहीं करते हैं। इन तकनीकी मुद्दों के विपरीत, सटीक-कट फेफड़ों का टुकड़ा (पीसीएलएस) विधि क्षेत्रीय पूर्वाग्रह के बिना तीन आयामों में फेफड़ों के ऊतकों की कल्पना करने के लिए एक कुशल विकल्प के रूप में लागू किया जा सकता है और 10 दिनों तक के लिए एक लाइव सरोगेट संकुचन मॉडल के रूप में सेवा करते हैं। पीसीएलएस का उपयोग करके तैयार ऊतकों ने संरचना और स्थानिक अभिविन्यास को संरक्षित किया है, जिससे यह रोग प्रक्रियाओं पूर्व वीवोका अध्ययन करने के लिए आदर्श बन गया है। एक प्रेरक tdTomato रिपोर्टर मुरीन मॉडल से काटा पीसीएलएस में अंतर्जात tdTomato लेबल कोशिकाओं के स्थान को सफलतापूर्वक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है। वासोकॉन्ट्रिकर्स के संपर्क में आने के बाद, पीसीएलएस पोत संकुचन और फेफड़ों की संरचना दोनों के संरक्षण को दर्शाता है, जिसे समय-चूक मॉड्यूल द्वारा कैप्चर किया जा सकता है। पश्चिमी दाग और आरएनए विश्लेषण जैसी अन्य प्रक्रियाओं के संयोजन में, पीसीएलएस विभिन्न प्रकार के विकारों को रेखांकित करने वाले झरने को संकेत देने की व्यापक समझ में योगदान दे सकता है और फेफड़े के संवहनी रोगों में रोगविज्ञान की बेहतर समझ पैदा कर सकता है।
शारीरिक संरचना का त्याग किए बिना सेलुलर घटकों को संरक्षित करने वाले फेफड़ों के ऊतकों की तैयारी और इमेजिंग में प्रगति फेफड़े की बीमारियों की विस्तृत समझ प्रदान करती है। शारीरिक संरचना को बनाए रखते हुए प्रोटीन, आरएनए और अन्य जैविक यौगिकों की पहचान करने की क्षमता कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्था के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करती है जो कई फेफड़े के रोगों में रोगविज्ञान की समझ को व्यापक बना सकती है। इन विस्तृत छवियों को फेफड़े की संवहनी रोगों की बेहतर समझ हो सकती है, जैसे फेफड़े की धमनी उच्च रक्तचाप, जब पशु मॉडल पर लागू होता है, संभावित रूप से बेहतर चिकित्सीय रणनीतियों के लिए अग्रणी होता है।
प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, मुरीन फेफड़ों के ऊतकों की उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करना एक चुनौती बनी हुई है । श्वसन चक्र साँस लेने के दौरान उत्पन्न नकारात्मक इंट्राथोरेसिक दबाव से प्रेरित होता है1. जब परंपरागत रूप से बायोप्सी प्राप्त करने और इमेजिंग के लिए फेफड़ों के नमूने तैयार करने, नकारात्मक दबाव ढाल वायुमार्ग और vasculature, जो अब अपने वर्तमान राज्य में ही प्रतिनिधित्व करता है के पतन में जिसके परिणामस्वरूप खो दिया है । वर्तमान परिस्थितियों को प्रतिबिंबित यथार्थवादी छवियों को प्राप्त करने के लिए, फेफड़े के वायुमार्ग को फिर से फुलाया जाना चाहिए, और वाक्यूलेचर एक स्थिर स्थिरता में गतिशील फेफड़ों को बदल दिया जाना चाहिए। इन विशिष्ट तकनीकों का अनुप्रयोग संरचनात्मक अखंडता, फेफड़े के वास्कुलेचर और सेलुलर घटकों के संरक्षण की अनुमति देता है, जिसमें मैक्रोफेज जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं, जिससे फेफड़ों के ऊतकों को यथासंभव अपनी शारीरिक स्थिति के करीब देखा जा सकता है।
सटीक कट फेफड़ों की टुकड़ा करने की क्रिया (पीसीएलएस) पल्मोनरी वैक्यूलेचर2के शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण है। पीसीएलएस संरचनात्मक और सेलुलर घटकों को संरक्षित करते हुए तीन आयामों में फेफड़ों के ऊतकों की विस्तृत इमेजिंग प्रदान करता है। पीसीएलएस का उपयोग पशु और मानव मॉडल में तीन आयामों में सेलुलर कार्यों के लाइव, उच्च-संकल्प छवियों के लिए अनुमति देने के लिए किया गया है, जिससे यह संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों का अध्ययन करने, छोटे वायुमार्ग संकुचन को मापने और सीओपीडी, आईएलडी और फेफड़ों के कैंसर जैसे पुराने फेफड़ों के रोगों के रोगविज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण बनगयाहै। इसी तरह की तकनीकों का उपयोग करना, वासोकॉन्ट्रिकर्स के लिए पीसीएलएस नमूनों के जोखिम फेफड़ों की संरचना और पोत संकुचन को संरक्षित कर सकते हैं, विट्रो स्थितियों में नकल । संकुचन के संरक्षण के साथ, तैयार नमूने आरएनए अनुक्रमण, पश्चिमी दाग, और प्रवाह साइटोमेट्री जैसे अतिरिक्त विश्लेषण से गुजरना कर सकते हैं जब सही ढंग से तैयार किया जाता है। अंत में, फेफड़ों की फसल के बाद tdTomato फ्लोरेसेंस के साथ चिह्नित रिपोर्टर रंग लेबल कोशिकाओं माइक्रोस्लिक्स तैयार करने के बाद लेबलिंग की रक्षा कर सकते हैं, यह सेल ट्रैकिंग अध्ययन के लिए आदर्श बना रही है । इन तकनीकों का एकीकरण कोशिकाओं और पोत संकुचन की स्थानिक व्यवस्था को संरक्षित करने वाला एक परिष्कृत मॉडल प्रदान करता है जो फेफड़े के वास्कुलेचर रोग में सिग्नलिंग कैस्केड और संभावित चिकित्सीय विकल्पों की अधिक विस्तृत समझ का कारण बन सकता है।
इस पांडुलिपि में, पीसीएलएस मुरीन फेफड़ों के ऊतक वासोकॉन्ट्रिकर्स के संपर्क में हैं, जो संरक्षित संरचनात्मक अखंडता और पोत संकुचन का प्रदर्शन करते हैं। अध्ययन दर्शाता है कि तैयार और उचित रूप से संभाला ऊतक 10 दिनों के लिए व्यवहार्य रह सकते हैं । अध्ययन भी अंतर्जात फ्लोरेसेंस (tdTomato) के साथ कोशिकाओं के संरक्षण को दर्शाता है, नमूनों फेफड़े के वास्कुलेचर और वास्तुकला के उच्च संकल्प छवियों को प्रदान करने के लिए अनुमति देता है । अंत में, अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए आरएनए माप और पश्चिमी दाग के लिए ऊतक स्लाइस को संभालने और तैयार करने के तरीके बताए गए हैं।
इस पांडुलिपि में, संवहनी संरचना को संरक्षित करने और प्रयोगात्मक लचीलेपन को अनुकूलित करने वाले मुरीन फेफड़ों के ऊतकों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का उत्पादन करने के लिए एक बढ़ी हुई विधि का वर्णन किया ग?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक डीआरएस युआन हाओ और कैफेंग लियू को उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे । इस काम को एक NIH 1R01 HL150106-01A1, पार्कर बी फ्रांसिस फैलोशिप, और पल्मोनरी उच्च रक्तचाप एसोसिएशन Aldrighetti अनुसंधान पुरस्कार डॉ के युआन को समर्थन दिया गया था ।
0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
30cc syringe | BD | 309650 | |
Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
Confocal | Zeiss | 880 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
Mortar and Pestle | Amazon | ||
RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |