前生体肺の構造と収縮性研究のための効率的なツールとしての精密切断肺スライス
Summary
ここに提示されるPCLSマウス肺組織の血管収縮性を維持するためのプロトコルは、多数の手順に影響を受けやすい最大10日間保存することができる肺血管構造および気道の洗練された3次元画像をもたらす。
Abstract
ネズミ肺組織の可視化は、基礎となる気道と脈管構造に関する貴重な構造および細胞情報を提供する。しかし、生理学的状態を真に表す肺血管の保存は依然として課題を提示する。さらに、マウスの肺の繊細な構成は、細胞の組成とアーキテクチャの両方を保持する高品質の画像のサンプルを準備する技術的な課題をもたらす。同様に、細胞収縮アッセイは 、細胞がインビトロで血管収縮剤に応答する可能性を研究するために行うことができるが、これらのアッセイは、無傷の肺の複雑な環境を再現しない。これらの技術的な問題とは対照的に、精密切断肺スライス(PCLS)法は、地域的バイアスなしで3次元で肺組織を可視化し、最大10日間の生きた代理収縮モデルとして機能する効率的な代替手段として適用することができる。PCLSを用いて作製された組織は、構造と空間的指向を保存しており、疾患プロセス ex vivoを研究するのに理想的です。誘導可能なtdTomatoレポーターマウスモデルから採取したPCLS中の内因性tdTomato標識細胞の位置を、共焦点顕微鏡でうまく可視化することができます。血管収縮剤に曝された後、PCLSは、血管収縮性と肺構造の両方の保存を示し、これはタイムラプスモジュールによって捕捉することができる。ウェスタンブロットやRNA解析などの他の手順と組み合わせて、PCLSは、多種多様な障害の根本となるシグナル伝達カスケードの包括的な理解に貢献し、肺血管疾患における病態生理学のより良い理解につながります。
Introduction
解剖学的構造を犠牲にすることなく細胞成分を保存する肺組織の調製およびイメージングの進歩は、肺疾患の詳細な理解を提供する。生理学的構造を維持しながらタンパク質、RNA、およびその他の生物学的化合物を同定する能力は、多数の肺疾患における病態生理学の理解を広げることができる細胞の空間的配置に関する重要な情報を提供する。これらの詳細な画像は、肺動脈高血圧症などの肺血管疾患を動物モデルに適用すると、より良い理解を導き、治療戦略の改善につながる可能性がある。
技術の進歩にもかかわらず、ネズミ肺組織の高品質の画像を得ることが課題です。呼吸周期は、吸入時に発生する負の胸腔内圧によって駆動される1.従来、生検を取得し、イメージング用の肺サンプルを準備すると、負圧勾配が失われ、気道と脈管構造が崩壊し、現在の状態ではもはや現像されません。現在の状態を反映した現実的な画像を実現するには、肺気道を再膨張させ、脈管構造を浸透させ、動的肺を静的な固定具に変える必要があります。これらの異なる技術の適用は、構造的完全性、肺血管系、およびマクロファージなどの免疫細胞を含む細胞成分の保存を可能にし、肺組織を可能な限り生理学的状態に近い状態で見ることができます。
精密切断肺スライス(PCLS)は、肺血管構造2の解剖学と生理学を研究するための理想的なツールです。PCLSは、構造および細胞成分を維持しながら、3次元で肺組織の詳細なイメージングを提供する。PCLSは、動物およびヒトモデルで使用され、細胞機能の生きた高解像度画像を3次元で撮影し、潜在的な治療目標を研究し、小さな気道収縮を測定し、COPD、ILD、肺がんなどの慢性肺疾患の病態生理学を研究するための理想的なツールとなっています3。同様の技術を使用して、PCLSサンプルを血管収縮剤に曝露することで、肺構造と血管収縮を維持し、 体外状態で 複製することができます。収縮性の維持に加えて、調製されたサンプルは、RNAシーケンシング、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーなどの追加の分析を正しく調製する場合に行うことができます。最後に、レポーターカラー標識細胞は、肺の収穫後にtdTomato蛍光でマークされ、マイクロスライスを調製した後に標識を保存することができ、細胞追跡研究に最適です。これらの技術の統合は、シグナル伝達カスケードのより詳細な理解と肺血管系疾患における潜在的な治療選択肢につながる細胞および血管収縮の空間的配置を維持する洗練されたモデルを提供する。
本稿では、PCLSマウス肺組織が血管収縮剤に曝され、保存された構造的完全性および血管収縮性を示す。この研究は、適切に調製され、処理された組織が10日間生存可能であり続けることができることを示している。この研究はまた、内因性蛍光(tdTomato)を有する細胞の保存を実証し、サンプルが肺血管構造および建築の高解像度画像を提供することを可能にする。最後に、RNA測定用の組織スライスを処理し、調製する方法と、基礎となるメカニズムを調査するためのウェスタンブロットについて説明した。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、血管構造を維持し、実験の柔軟性を最適化するマウス肺組織の高解像度画像を生成する強化された方法が記載されており、特にPCLSの適用を用いて、血管系の収縮を3次元で見ることができる肺組織の微小スライスを得る。生存率試薬を使用して、プロトコルは慎重に調製され、保存されたスライスが1週間以上生存率を保持できることを実証する。マイクロスライスの生存率を維持?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、元ハオ博士と劉英博士の技術支援に感謝したいと考えています。この研究は、NIH 1R01 HL150106-01A1、パーカーB.フランシスフェローシップ、およびケ・ユアン博士に対する肺高血圧協会アルドリゲッティ研究賞によって支えられていました。
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
Referências
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