Автоматизированный протокол рассечения для обогащения опухоли в тканях с низким содержанием опухоли
Summary
Цифровая аннотация с автоматизированным рассечением тканей обеспечивает инновационный подход к обогащению опухоли в случаях с низким содержанием опухоли и адаптируется как к парафиновым, так и к замороженным типам тканей. Описанный рабочий процесс повышает точность, воспроизводимость и пропускную способность и может применяться как к исследованиям, так и к клиническим условиям.
Abstract
Обогащение опухоли в тканях с низким содержанием опухоли, которые ниже 20% содержания опухоли в зависимости от метода, требуется для воспроизводимой генерации качественных данных со многими последующими анализами, такими как секвенирование следующего поколения. Автоматизированная рассечение тканей – это новая методология, которая автоматизирует и улучшает обогащение опухоли в этих распространенных тканях с низким содержанием опухоли за счет уменьшения зависящей от пользователя неточности традиционной макродиссекции и ограничений времени, стоимости и опыта микродиссекции лазерного захвата с использованием наложения аннотаций цифрового изображения на незапятнанные слайды. Здесь цифровые аннотации гематоксилина и эозина (H & E) используются для нацеливания на небольшие области опухоли с использованием лезвия диаметром 250 мкм2 в неокрашенном фиксированном парафине формалина (FFPE) или свежезамороженных участках толщиной до 20 мкм для автоматизированного обогащения опухоли до экстракции нуклеиновых кислот и секвенирования всего экзома (WES). Автоматизированное рассечение может собирать аннотированные области в тканях с низким содержанием опухоли из одного или нескольких секций для экстракции нуклеиновых кислот. Он также позволяет собирать обширные метрики сбора до и после сбора урожая, одновременно повышая точность, воспроизводимость и увеличивая пропускную способность с использованием меньшего количества слайдов. Описанный протокол обеспечивает цифровую аннотацию с автоматическим рассечением на животных и/или человеческих FFPE или свежезамороженных тканях с низким содержанием опухоли, а также может быть использован для обогащения любой интересующей области для повышения адекватности для последующих приложений секвенирования в клинических или исследовательских рабочих процессах.
Introduction
Секвенирование следующего поколения (NGS) все чаще используется как для ухода за пациентами, так и для исследований рака, чтобы помочь в руководстве лечением и облегчить научные открытия. Ткань часто ограничена, и обычно используются небольшие образцы с переменным содержанием опухоли. Таким образом, адекватность и целостность опухоли остаются препятствием для получения значимых данных. Образцы с более низким процентом опухоли могут вызвать трудности в различении истинных вариантов от артефактов секвенирования и часто не имеют права на NGS1. Было показано, что обогащение опухоли в случаях с низким содержанием опухоли, ниже 20%, помогает получить достаточное количество материала для получения воспроизводимых данных секвенирования и обеспечения того, чтобы низкочастотные варианты не были пропущены 2,3. Однако ограничения будут варьироваться в зависимости от используемых платформ и планируемого использования генерируемых данных.
Традиционно обогащение опухолевых областей для экстракции выполняется ручной макродиссекцией или лазерной микродиссекцией захвата (LCM) формалиновых фиксированных парафиновых встроенных (FFPE) слайдов. Ручная макродиссекция или соскоб определенных участков тканей со слайдов позволяет удалять опухолевые области для использования в последующих анализах с относительно низкой стоимостью, но с низкой точностью и низкой точностью 2,4. Минимальная техническая точность может быть очень эффективной в случаях с более высоким содержанием опухоли, когда присутствуют большие участки опухоли и / или минимальная потеря ткани существенно не влияет на результаты, но случаи с низким содержанием опухоли или случаи с более дисперсной опухолью требуют повышенной точности. Поэтому LCM был изобретен в 1990-х годах и стал ценным способом точного удаления небольших, определенных, микроскопических областей ткани из формалиновых фиксированных парафиновых встроенных (FFPE) слайдов 5,6,7,8. LCM может быть использован для сбора одиночных клеточных популяций, когда существует сложная гетерогенность образца9, позволяющая собирать ранее трудно разделяемые клеточные популяции. Тем не менее, LCM требует дорогостоящего оборудования, которое требует обширных технических знаний и практического времени 10,11,12,13,14.
Инструмент, используемый для автоматизированного рассечения тканей, имеет точность между LCM (~ 10 мкм) и макродиссекции (~ 1 мм) 15. Кроме того, он демонстрирует как затратные, так и технические требования к экспертизе между макродиссекцией и LCM и предназначен для выполнения быстрого обогащения тканей последовательными слайдами FFPE для смягчения недостатков предыдущих методов15. Автоматизированное рассечение таким образом использует цифровые аннотации или накладки эталонных изображений слайдов на сцене на последовательно секционированные неокрашенные тканевые слайды для рассечения и обогащения областей, представляющих интерес. Инструмент использует пластиковые наконечники для фрезерования прядильных лезвий, коллекторные трубки объемом 1,5 мл и может использоваться с рядом различных жидкостей для рассечения для сбора областей, представляющих интерес для последующих анализов, включая нуклеиновую экстракцию и секвенирование. Вращающийся пластиковый фрезерный наконечник использует внутренние и внешние резервуары для шприцевых бочек и плунжер для сбора буфера, а затем фрезерует и собирает ткань16. Переменный диаметр фрезерного наконечника (250 мкм, 525 мкм, 725 мкм) может позволить рассечение отдельных областей ткани для сравнения, мультифокальных областей, которые могут быть объединены, или отдельных небольших областей из одного или нескольких слайдов FFPE. Толщина секций, используемых для сбора урожая, может быть скорректирована на основе индивидуальных потребностей эксперимента, и пользователи могут гарантировать, что интересующие регионы не были исчерпаны, выполнив дополнительный H &E на одной последовательной секции сразу после последней секции, используемой для сбора урожая.
Автоматизированное рассечение было идентифицировано как способ обогащения опухолевого содержания в случаях с низким содержанием опухоли, и мы протестировали и расширили предполагаемую функциональность автоматизированного инструмента для рассечения тканей, который в настоящее время продается для использования на клинических образцах FFPE толщиной до 10 мкм. Работа показывает, что автоматизированное рассечение может быть применено как к FFPE, так и к свежезамороженным участкам тканей человека или животных толщиной до 20 мкм в исследовательских целях. Протокол также демонстрирует подход к цифровому аннотированию и автоматизации рассечения для обогащения опухоли в тканях с низким содержанием опухоли и / или случаях с вложенной, дисперсной опухолью, где значимая макродиссекция является сложной или неосуществимой, и показывают как качество, так и выход нуклеиновой кислоты, достаточные для NGS. Таким образом, автоматизированная рассечение может обеспечить точность среднего уровня и повышенную пропускную способность для обогащения опухоли, а также может применяться для обогащения других областей, представляющих интерес, или в сочетании с другими платформами для ответа на исследовательские или клинические вопросы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь представлен протокол применения цифровой аннотации и автоматизированного рассечения для рассечения опухолевых областей от низкоопухолевых FFPE или свежезамороженных тканей для обогащения опухоли и использования в WES. Сочетание цифровой аннотации и создания маски с автоматизир?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Кармину Эспириту и Робина Э. Тейлора за их поддержку в разработке автоматизированного вскрытия, а также сотрудников Genentech Pathology Core Laboratory, которые поддержали эту работу.
Materials
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
Referências
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center’s experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett’s Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).
