엑소시토시스의 자동 검출 및 분석
Summary
pH 에 민감한 형광 프로브로 표시된 외식 이벤트를 감지하기 위해 자동화된 컴퓨터 비전 소프트웨어를 개발했습니다. 여기서는 그래픽 사용자 인터페이스와 RStudio를 사용하여 융합 이벤트를 감지하고, 융합의 현면 파라미터를 분석하고 표시하며, 이벤트를 고유한 융합 모드로 분류합니다.
Abstract
소포 SNARE 단백질에 부착된 pH-민감한 GFP(pHluorin)의 타임랩스 TIRF 현미경 검사는 세포 배양에서 단일 소포 외세포 이벤트를 시각화하는 효과적인 방법입니다. 이러한 이벤트에 대한 편견없고 효율적인 식별 및 분석을 수행하기 위해 MATLAB에서 컴퓨터 비전 기반 접근 방식을 개발하고 구현했습니다. 분석 파이프라인은 셀 세분화 및 외식 이벤트 식별 알고리즘으로 구성됩니다. 컴퓨터 비전 접근법에는 형광 부패및 피크 ΔF/F의 반감기를 비롯한 단일 이벤트의 여러 매개 변수를 조사하는 도구뿐만 아니라 외세포증 주파수의 전체 세포 분석을 포함하는 도구가 포함되어 있습니다. 이러한 융합의 매개 변수및 기타 매개 변수는 뚜렷한 융합 모드를 구별하기 위한 분류 접근 방식에 사용됩니다. 여기서 새로 구축된 GUI는 처음부터 끝까지 분석 파이프라인을 수행합니다. R Studio에서 Ripley의 K 기능을 추가로 조정하여 공간과 시간 모두에서 클러스터, 분산 또는 임의의 융합 이벤트를 구별하는 데 사용됩니다.
Introduction
VAMP-pHluorin 구조 또는 트랜스프레린 수용체(TfR)-pHuji 구조는 이러한 pH 민감형 형광류가 소포와 혈장 멤브레인1사이의 융합 모공 개구 시 즉시 산 소포 루멘 및 형광 내에 담금질되기 때문에 외세포 현상의 우수한 마커이다. 퓨전 모공 개구부에 이어 형광은 기하급수적으로 부패하며 융합 이벤트에 대한 정보를 드러내는 이질성도가 있습니다. 여기서, 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 응용 프로그램은 자동으로 외세포 이벤트를 감지하고 분석하는 설명입니다. 이 응용 프로그램은 사용자가 자동으로 pH 민감한마커에 의해 공개 엑소시틱 이벤트를 감지 할 수 있습니다 2 분류 목적 에 사용할 수있는 각 이벤트에서 기능을 생성(그림 1A). 또한, 리플리의 K 함수를 이용한 외식 이벤트 클러스터링의 분석이 설명된다.
다른 외세포 모드로 외세포 이벤트의 자동화 된 분류는 최근보고되었다3. 엑소시토시스의 두 가지 모드, 풀 소포 융합(FVF) 및 키스 앤런 융합(KNR) 엑소시토시스는 이전에4,5,6,7로설명되었다. FVF 동안, 융합 모공팽창, 및 소포는 플라즈마 멤브레인에 통합된다. KNR 동안 융합 공공은 일시적으로 열리고4,5,8,9,10을다시 밀봉합니다. 4가지 엑소시토시스 는 뉴런 개발에서 확인되었으며, 2개는 FVF와 관련이 있으며 KNR과 관련된 2가지. 이 작품은 FVF와 KNR 모두 형광 붕괴가 시작되기 전에 융합 모공 개구(FVFd 및 KNRd)(도 1B)가시작되기 전에 융합 모공 개구 후 지연을 나타내는 융합 모공 개구 또는 외세포 이벤트 후 즉시 형광 붕괴(FVFi 및 KNRi)로 진행되는 융합 이벤트로 더욱 세분화될 수 있음을 보여준다. 분류자는 각 융합 이벤트에 대한 외세포증 모드를 식별합니다. 이 분석은 Windows 및 Mac 기반 운영 체제의 MATLAB에 설치할 수 있는 GUI에 통합되었습니다. 모든 분석 파일은 https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing 또는
https://github.com/GuptonLab.
Protocol
Representative Results
Discussion
외식 감지 및 분석 소프트웨어를 사용하는 경우 프로그램은 무손실 압축 .tif 파일만 입력으로 수락한다는 점을 고려하십시오. .tif 이미지 파일은 8비트, 16비트 또는 32비트 그레이스케일(단일 채널) 이미지일 수 있습니다. 다른 이미지 형식은 입력하기 전에 이러한 유형 중 하나로 변환해야 합니다. 참고로 여기에서 사용되는 예제는 16비트 회색 크기 이미지입니다.
자동 감지 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 코드와 GUI를 테스트 더스틴 Revell 및 레지널드 에드워즈 감사합니다. 자금은 이 연구를 지원하는 국립 보건원에 의해 제공되었습니다: R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG), F31NS103586 (독감)을 포함.
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Referências
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