Автоматизированное обнаружение и анализ экзоцитоза
Summary
Мы разработали автоматизированное программное обеспечение для компьютерного зрения для обнаружения экзоцитарных событий, отмеченных pH-чувствительными флуоресцентными зондами. Здесь мы демонстрируем использование графического пользовательского интерфейса и RStudio для обнаружения событий слияния, анализа и отображения пространственно-временных параметров слияния и классификации событий в различные режимы слияния.
Abstract
Замедленная TIRF-микроскопия pH-чувствительного GFP (pHluorin), прикрепленного к белкам SNARE везикул, является эффективным методом визуализации одиночных экзоцитарных событий в клеточной культуре. Для проведения непредвзятой, эффективной идентификации и анализа таких событий в MATLAB был разработан и внедрен подход, основанный на компьютерном зрении. Конвейер анализа состоит из алгоритма сегментации клеток и идентификации экзоцитарных событий. Подход компьютерного зрения включает в себя инструменты для исследования множественных параметров единичных событий, включая период полураспада флуоресценции и пик ΔF/F, а также общеклеточный анализ частоты экзоцитоза. Эти и другие параметры синтеза используются в классификационном подходе для различения различных режимов синтеза. Здесь недавно созданный графический интерфейс выполняет конвейер анализа от начала до конца. Дальнейшая адаптация K-функции Рипли в R Studio используется для различения кластеризованным, рассеянным или случайным возникновением событий слияния как в пространстве, так и во времени.
Introduction
Конструкции VAMP-pHluorin или конструкции рецептора трансферрина (TfR)-pHuji являются отличными маркерами экзоцитарных событий, поскольку эти pH-чувствительные флуорофоры гасятся в просвете кислых езикул и флуоресцируют сразу после открытия пор слияния между везикулой и плазматической мембраной1. После открытия пор синтеза флуоресценция распадается экспоненциально, с некоторой неоднородностью, которая раскрывает информацию о событии синтеза. Здесь описано приложение графического интерфейса пользователя (GUI), которое автоматически обнаруживает и анализирует экзоцитарные события. Это приложение позволяет пользователю автоматически обнаруживать экзоцитарные события, выявленные чувствительными к pH маркерами2, и генерировать признаки из каждого события, которые могут быть использованы для целей классификации3 (рисунок 1A). Кроме того, описан анализ кластеризации экзоцитарных событий с использованием K-функции Рипли.
Автоматизированная классификация экзоцитарных событий в различные экзоцитарные режимы была недавно сообщена3. Два режима экзоцитоза, полное везикулярное слияние (FVF) и слияние поцелуев (KNR), ранее были описаны4,5,6,7. Во время FVF пора слияния расширяется, и везикула включается в плазматическую мембрану. Во время KNR пора плавления временно открывается, а затем повторно засовывает4,5,8,9,10. Четыре режима экзоцитоза были идентифицированы в развивающихся нейронах, два из которых связаны с FVF и два связаны с KNR. Эта работа демонстрирует, что как FVF, так и KNR могут быть дополнительно подразделены на события синтеза, которые немедленно переходят к флуоресцентному распаду (FVFi и KNRi) после открытия пор синтеза или экзоцитарным событиям, которые проявляют задержку после открытия пор синтеза до начала распада флуоресценции (FVFd и KNRd)(рисунок 1B). Классификатор определяет режим экзоцитоза для каждого события слияния. Здесь этот анализ был включен в графический интерфейс, который может быть установлен в MATLAB в операционных системах windows и Mac. Все файлы анализа можно найти по адресу https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing или
https://github.com/GuptonLab.
Protocol
Representative Results
Discussion
При использовании программного обеспечения для обнаружения и анализа экзоцитов, пожалуйста, учитывайте, что программа принимает только сжатие без потерь .tif файлы в качестве входных данных. Файлы изображений .tif могут быть 8-битными, 16-битными или 32-битными изображениями в градациях сер?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Дастина Ревелла и Реджинальда Эдвардса за тестирование кода и графического интерфейса. Финансирование было предоставлено Национальными институтами здравоохранения, поддержали это исследование: в том числе R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) и F31NS103586 (FLU).
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Referências
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
