Automatiseret påvisning og analyse af exocytose
Summary
Vi udviklede automatiseret computer vision software til at opdage exocytiske hændelser præget af pH-følsomme fluorescerende sonder. Her demonstrerer vi brugen af en grafisk brugergrænseflade og RStudio til at registrere fusionshændelser, analysere og vise spatiotemporale parametre for fusion og klassificere hændelser i forskellige fusionstilstande.
Abstract
Timelapse TIRF mikroskopi af pH-følsomme GFP (pHluorin) knyttet til vesikel SNARE proteiner er en effektiv metode til at visualisere enkelt vesikel exocytiske begivenheder i cellekulturen. For at udføre en upartisk, effektiv identifikation og analyse af sådanne hændelser blev der udviklet og implementeret en computervisionsbaseret tilgang i MATLAB. Analysepipelinen består af en cellesegmentering og en algoritme til identifikation af exocytiske begivenheder. Computersynsmetoden omfatter værktøjer til undersøgelse af flere parametre for enkelthændelser, herunder halveringstid for fluorescens henfald og peak ΔF/F samt helcelleanalyse af hyppigheden af exocytose. Disse og andre fusionsparametre anvendes i en klassificeringsmetode til at skelne mellem forskellige fusionstilstande. Her udfører en nybygget GUI analysepipeline fra start til slut. Yderligere tilpasning af Ripleys K-funktion i R Studio bruges til at skelne mellem grupperet, spredt eller tilfældig forekomst af fusionshændelser i både rum og tid.
Introduction
VAMP-pHluorin konstruerer eller transferrin receptor (TfR)-pHuji konstruktioner er fremragende markører for exocytiske begivenheder, da disse pH-følsomme fluorophorer slukkes i syre vesikel lumen og fluoresce umiddelbart efter fusion pore åbning mellem vesikel og plasmamembran1. Efter fusion pore åbning, henfalder fluorescens eksponentielt, med en vis heterogenitet, der afslører oplysninger om fusion begivenhed. Her beskrives et grafisk brugergrænsefladeprogram, der automatisk registrerer og analyserer exocytiske hændelser. Denne applikation giver brugeren mulighed for automatisk at registrere exocytiske hændelser afsløret af pH-følsomme markører2 og generere funktioner fra hver hændelse, der kan bruges til klassificeringsformål3 (Figur 1A). Derudover beskrives analyse af exocytisk hændelsesklynge ved hjælp af Ripleys K-funktion.
Den automatiserede klassificering af exocytiske hændelser i forskellige exocytiske tilstande blev for nylig rapporteret3. To former for exocytose, fuld-vesikel fusion (FVF) og kys-og-run fusion (KNR) exocytose er tidligere blevet beskrevet4,5,6,7. Under FVF udvides fusionsporen, og vesikel er indarbejdet i plasmamembranen. Under KNR åbner fusionsporen forbigående og reseals4,5,8,9,10. Fire former for exocytose blev identificeret i udviklingen af neuroner, to relateret til FVF og to relateret til KNR. Dette arbejde viser, at både FVF og KNR yderligere kan opdeles i fusion begivenheder, der går straks til fluorescens henfald (FVFi og KNRi) efter fusion pore åbning eller exocytiske begivenheder, der udviser en forsinkelse efter fusion pore åbning før fluorescens henfald begynder (FVFd og KNRd) (Figur 1B). Klassificeringen identificerer exocytosemåden for hver fusionshændelse. Her er denne analyse blevet indarbejdet i en GUI, der kan installeres i MATLAB i Windows- og Mac-baserede operativsystemer. Alle analysefiler kan findes på https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing eller
https://github.com/GuptonLab.
Protocol
Representative Results
Discussion
Når du bruger den exocytiske detektions- og analysesoftware, skal du overveje, at programmet kun accepterer tabsfri komprimering .tif filer som input. De .tif billedfiler kan være 8-bit, 16-bit eller 32-bit gråtonebilleder (enkeltkanalsbilleder). Andre billedformater skal konverteres til en af disse typer, før der indtastes. Som reference er eksempler, der bruges her, 16-bit gråtonebilleder.
Tidslapsbilledsættene, der er indbygget i den automatiserede detektionsproces, behandles til auto…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dustin Revell og Reginald Edwards for testkode og GUI. Finansieringen blev ydet af National Institutes of Health støttede denne forskning: herunder R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG), og F31NS103586 (FLU).
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Referências
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
