Automatisierte Erkennung und Analyse von Exozytose
Summary
Wir haben eine automatisierte Computer-Vision-Software entwickelt, um exozytäre Ereignisse zu erkennen, die durch pH-sensitive Fluoreszenzsonden gekennzeichnet sind. Hier demonstrieren wir die Verwendung einer grafischen Benutzeroberfläche und RStudio, um Fusionsereignisse zu erkennen, räumlich-zeitliche Parameter der Fusion zu analysieren und anzuzeigen und Ereignisse in verschiedene Fusionsmodi zu klassifizieren.
Abstract
Die Zeitraffer-TIRF-Mikroskopie von pH-sensitivem GFP (pHluorin), das an Vesikel-SNARE-Proteine gebunden ist, ist eine effektive Methode, um exozytäre Ereignisse einzelner Vesikel in Zellkulturen sichtbar zu machen. Um eine unvoreingenommene, effiziente Identifizierung und Analyse solcher Ereignisse durchzuführen, wurde ein Computer-Vision-basierter Ansatz entwickelt und in MATLAB implementiert. Die Analysepipeline besteht aus einem Zellsegmentierungs- und exozyttischen Ereignisidentifikationsalgorithmus. Der Computer-Vision-Ansatz umfasst Werkzeuge zur Untersuchung mehrerer Parameter einzelner Ereignisse, einschließlich der Halbwertszeit des Fluoreszenzzerfalls und des Peak-ΔF / F sowie der Ganzzellanalyse der Häufigkeit der Exozytose. Diese und andere Parameter der Fusion werden in einem Klassifikationsansatz verwendet, um verschiedene Fusionsmodi zu unterscheiden. Hier führt eine neu erstellte GUI die Analysepipeline von Anfang bis Ende durch. Eine weitere Anpassung von Ripleys K-Funktion in R Studio wird verwendet, um zwischen geclusterten, dispergierten oder zufälligen Auftreten von Fusionsereignissen in Raum und Zeit zu unterscheiden.
Introduction
VAMP-pHluorin-Konstrukte oder Transferrinrezeptor (TfR)-pHuji-Konstrukte sind ausgezeichnete Marker für exozytäre Ereignisse, da diese pH-sensitiven Fluorophore im sauren Vesikellumen abgeschreckt werden und unmittelbar nach der Fusionsporenöffnung zwischen Vesikel und Plasmamembran fluoreszieren1. Nach der Öffnung der Fusionsporen zerfällt die Fluoreszenz exponentiell, mit einer gewissen Heterogenität, die Informationen über das Fusionsereignis preisgibt. Hier wird eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) beschrieben, die exozytäre Ereignisse automatisch erkennt und analysiert. Diese Anwendung ermöglicht es dem Benutzer, exozytäre Ereignisse, die durch pH-empfindliche Marker2 aufgedeckt werden, automatisch zu erkennen und aus jedem Ereignis Merkmale zu generieren, die für Klassifizierungszwecke verwendet werden können3 (Abbildung 1A). Zusätzlich wird die Analyse des exozyttischen Ereignisclusterings mit Ripleys K-Funktion beschrieben.
Die automatisierte Klassifizierung exozytischer Ereignisse in verschiedene exozytäre Modi wurde kürzlich berichtet3. Zwei Modi der Exozytose, die Vollvesikelfusion (FVF) und die Kiss-and-Run-Fusion (KNR) Exozytose, wurden zuvor beschrieben4,5,6,7. Während der FVF erweitert sich die Fusionspore und das Vesikel wird in die Plasmamembran eingebaut. Während des KNR öffnet sich die Fusionspore vorübergehend und verschließt dann4, 5,8,9,10. Vier Modi der Exozytose wurden in sich entwickelnden Neuronen identifiziert, zwei verwandt mit FVF und zwei mit KNR. Diese Arbeit zeigt, dass sowohl FVF als auch KNR weiter unterteilt werden können in Fusionsereignisse, die unmittelbar zum Fluoreszenzzerfall (FVFi und KNRi) nach Fusionsporenöffnung übergehen, oder exozytäre Ereignisse, die eine Verzögerung nach der Fusionsporenöffnung aufweisen, bevor der Fluoreszenzzerfall beginnt (FVFd und KNRd) (Abbildung 1B). Der Klassifikator identifiziert den Modus der Exozytose für jedes Fusionsereignis. Hier wurde diese Analyse in eine GUI integriert, die in MATLAB in Windows- und Mac-basierten Betriebssystemen installiert werden kann. Alle Analysedateien finden Sie unter https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing oder
https://github.com/GuptonLab.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bitte beachten Sie bei der Verwendung der exozytischen Erkennungs- und Analysesoftware, dass das Programm nur verlustfreie Komprimierung .tif Dateien als Eingabe akzeptiert. Die .tif Bilddateien können 8-Bit-, 16-Bit- oder 32-Bit-Graustufenbilder (Einzelkanal) sein. Andere Bildformate müssen vor der Eingabe in einen dieser Typen konvertiert werden. Als Referenz werden hier Beispiele als 16-Bit-Graustufenbilder verwendet.
Im Rahmen des automatisierten Erkennungsprozesses werden die Zeitraffer…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dustin Revell und Reginald Edwards für das Testen von Code und GUI. Die Finanzierung wurde von den National Institutes of Health zur Verfügung gestellt, die diese Forschung unterstützten: einschließlich R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) und F31NS103586 (FLU).
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Referências
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
